昆虫细胞系统的蛋白表达与纯化

 一、常见的蛋白表达系统
为了表达和纯化目的蛋白，常见的蛋白表达体系包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞表达系统和体外翻译体系等，其中实验室中比较常用的是大肠杆菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞表达细胞。大肠杆菌可以表达一些对于翻译后修饰没有什么要求的蛋白，操作最简单便捷，适合低成本大量表达目的蛋白；昆虫细胞可以表达一些需要简单的糖基化修饰等的蛋白，操作比大肠杆菌复杂但比哺乳动物细胞要简单一些，目的蛋白的表达纯化的成本高于大肠杆菌但低于哺乳动物细胞；哺乳动物细胞适合表达需要复杂翻译后修饰的蛋白，目的蛋白的表达纯化的成本相对较高。体外翻译系统大多用于蛋白翻译的研究，仅在特殊情况下才会用于目的蛋白的表达和纯化；酵母用于目的蛋白的表达和纯化相对比较常见一些，其中获得的蛋白的修饰程度和成本介于大肠杆菌和昆虫表达系统之间。昆虫或者哺乳动物表达系统，相当于把生物体作为了反应器，用于表达和纯化所需的目的蛋白。
产品中包含了大肠杆菌蛋白表达纯化系统、昆虫细胞蛋白表达纯化系统和哺乳动物蛋白表达纯化系统。
提供的大肠杆菌蛋白表达纯化系统主要采用pET系列质粒，转化到BL21系列等菌株中，进行目的蛋白的表达，后续使用镍柱或GST柱进行目的蛋白的纯化。该系统不仅适合小量目的蛋白的表达纯化，也适合较大量的目的蛋白的表达纯化。
昆虫蛋白表达纯化系统，可以采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统, 通过LipoInsect™转染试剂感染Sf9等昆虫细胞，最终通过镍柱、GST柱等方法进行目的蛋白的表达和纯化。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是由Luckow等人于1993年发展的一种快速有效产生重组杆状病毒的方法，也是到目前为止使用最为广泛的昆虫表达系统。
哺乳细胞表达系统包括小量目的蛋白的表达纯化和大量目的蛋白的表达纯化两种。进行小量目的蛋白的表达纯化时，通常可以采用pCMV等系列真核表达载体，使用脂质体或磷酸钙等转染试剂转染细胞后，进行目的蛋白的表达，随后可以采用目的蛋白抗体或所带的标签抗体进行免疫沉淀，也可以考虑采用镍柱或GST柱进行目的蛋白的纯化；进行大量目的蛋白的表达纯化时，可采用Lipo293F™转染试剂大量转染293f细胞，从而实现大规模的蛋白表达与后续的纯化。

二、昆虫蛋白表达和纯化系统

昆虫杆状病毒表达载体系统(Baculovirus Expression Vector Systems, BEVS)是一个二元系统。第一个部分是病毒感染的昆虫宿主，通常是鳞翅目昆虫细胞系，有时也可以是鳞翅目的昆虫。第二个部分是杆状病毒表达载体，其功能是将编码目标蛋白的外源基因导入宿主细胞中、组装杆状病毒并进行目的蛋白的表达。
1.昆虫细胞
鳞翅目昆虫(Order Lepidoptera)包括蛾(moth)和蝴蝶(butterfly)，它们是杆状病毒家族中多种病毒的宿主。目前已经建立了超过250种的昆虫细胞株。杆状病毒表达载体涉及的最常用的鳞翅类昆虫细胞株有两个，其中一个是Sf9, 由Smith和 Summers在1987年亚克隆IPLB-SF-21而建立的。IPLB-SF-21细胞系是在1977年从草地贪夜蛾(又称为秋天行军虫)蛹的卵巢组织中分离出来的；另外一个是HighFive, 最初是从粉纹夜蛾(又称为甘蓝银纹夜蛾)(cabbageIooper)的成熟卵巢组织中分离到的细胞株。

Sf9/Sf21和HighFive两种细胞系都能以贴壁或悬浮状态生长。通过感染在培养板或培养瓶中生长的 Sf9/Sf21或 HighFive细胞，可以很方便地实现实验室规模的蛋白质生产的目的。昆虫细胞培养的条件和方法与哺乳动物细胞的培养方法不太一样，昆虫细胞的培养温度是25-30℃，最适温度是28℃而不是37℃；另外，Sf9/ Sf21和HighFive细胞贴壁不紧, 在传代培养时不需要EDTA或胰酶(trypsin)处理；昆虫细胞的生长也不需要CO2培养箱，因为昆虫细胞培养液通常是用磷酸盐而不是碳酸盐作为缓冲液。Sf9/Sf21和HighFive细胞都可以在有或没有血清的培养液中生长。多种不同的昆虫细胞培养液都能够从多个不同的制造商买到，其中包括ExpressionSystems、Invitrogen(GIB-CO)、HyClone和Sigma-Aldrich。有血清培养液主要有Grace's insect cell culture medium，TNM-FH，IPL-41,TC-100和Schneider's insect medium等，而无血清培养液主要有SF-900II SFM，SF-900III SFM和Express-Five SFM等特别适合蛋白的大规模表达。需要指出的是，Sf9/Sf21和HighFive细胞都会倾向于逐渐适应某种特定的培养液，如果突然将它们的培养液从有血清培养液变为无血清培养液时往往会导致培养细胞的损失。因此通常建议采用"缓慢培养液更换法"，如在连续传代中，应该将无血清培养液的比例从0% 依次升高至25%、50%、75%，直至100%。即使使用这种相对缓慢的血清戒除法，当将细胞刚刚置于不含血清的培养液时，这些细胞也会经历短暂的生长停止或生长缓慢，但这些细胞会在新培养液中缓慢生长12天后恢复至正常的生长速率。"缓慢培养液更换法"不仅可实现从有血清培养液到无血清培养液的转换，还可以用于将昆虫细胞从一种无血清培养液转移到另一种无血清培养液。
昆虫细胞可作为杆状病毒感宿主而进行高水平的外源蛋白的表达，来自昆虫杆状病毒表达系统的重组蛋白通常具有正确的翻译后修饰和生物学活性，其翻译后蛋白修饰状态与哺乳动物类似，当然这种加工与哺乳动物细胞对蛋白质的加工并不总是相同，比较明显的一个例子就是蛋白的N-糖基化修饰有所不同。Invitrogen将一个最初命名为SfSWT-I的源于Sf9细胞的转基因昆虫细胞系命名为Mimic Sf9, 该细胞系具有更完整的N-糖基化途径，在含有血清的培养液中能够表达出人源化的重组糖蛋白。
2. 昆虫杆状病毒表达系统
与大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞等其它常用的重组蛋白表达系统相比，昆虫杆状病毒表达系统具有以下独特的优点：
(1) 与大肠杆菌表达系统相比，对于某些容易在大肠杆菌表达系统中由于二硫键错误配对或者缺乏蛋白翻译后修饰(如磷酸化和糖基化等)而形成包涵体的蛋白，在大多数情况下，在昆虫表达系统中高水平表达的重组蛋白往往可溶，而且能折叠正确，并且含有对某些蛋白活力所必须的翻译后修饰(如磷酸化和糖基化等)。
(2) 与酵母和哺乳动物表达系统等其它真核表达系统相比，外源基因表达水平高，非常适应大规模表达所需的高密度悬浮培养，而且比较容易分离纯化。
(3) 昆虫细胞由于悬浮生长，容易进行放大培养，从而可进行大规模的重组蛋白表达纯化，昆虫杆状病毒表达系统广泛应用于科研和工业生产领域，重组蛋白产量最高可达1g/L。
(4) 昆虫细胞可用于同时表达多种重组蛋白，可通过多种重组病毒同时感染昆虫细胞或用含有多个表达框的一种病毒感染昆虫细胞来实现。所以该系统特别适合表达多亚基的蛋白复合物以进行蛋白的结构功能研究等。
(5) 生物安全性高。昆虫杆状病毒具有严格的宿主范围，通常仅限于非脊椎动物，因此具有生物安全性高这一特点。
3. Bac-to-Bac杆状病毒表达系统
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是由Luckow等人于1993年发展的一种快速有效产生重组杆状病毒的方法，也是到目前为止使用最为广泛的昆虫杆状病毒表达系统。该系统主要包括以下两个组分：(1) 用于插入目的基因的pFastBac载体，在该系列载体中，目的基因的高水平表达由Autographa californica多核多角体病毒(multiple nuclear polyhedrosis virus, AcMNPV)的多角体启动子(polyhedrin(PH)promoter)驱动。载体多克隆位点的两侧均为Tn7元件，同时还含有一个庆大霉素抗性基因(gentamicin resistance gene)和形成mini Tn7所需的SV40 polyA signal。(2)含杆状病毒穿梭载体bacmid (bMON14272, 136kb)和辅助质粒(helper plasmid，用于表达转座必须的转座蛋白) pMON7124的大肠杆菌DH10Bac宿主菌株。Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统利用遗传转座(genetic transposition)得到重组病毒。DH10Bac宿主包含的bacmid bMON14272含小型F复制子，卡那霉素抗性基因，mini-attTn7位点和lacZα互补因子(可通过蓝白斑筛选)；辅助质粒pMON7124包含四环素抗性和tnsABCD区域，该区域表达转座反应所需的转座蛋白。当pFastBac重组质粒转化进入DH10Bac细胞后，pFastBac载体上的mini-Tn7位点和DH10Bac宿主菌中bacmid上的mini-attTn7位点之间发生转座(transposition)，产生重组bacmid。该转座会导致bacmid上的LacZ基因的破坏，因此可以通过在细菌培养平板上进行蓝白斑筛选来鉴别含有重组bacmid的DH10Bac菌落，从白色菌落的DH10Bac克隆中可分离出含有编码目的基因的重组bacmid DNA，后者进一步感染昆虫细胞后可产生含有重组子的杆状病毒即可启动外源重组蛋白的表达。表达目的蛋白的杆状病毒在被扩增和滴度测定后，高滴度的杆状病毒即可用于感染昆虫细胞以进行大规模的目的蛋白的表达。
4. Bac-to-Bac杆状病毒表达系统进行目的蛋白表达的实验步骤
(1)把目的基因克隆至pFastBac系列载体产生重组质粒。根据pFastBac系列载体的多克隆位点选做合适的酶切位点，按照读码框插入待表达的目的基因序列。最后通过测序验证插入序列是否正确。
(2)转化pFastBac重组质粒到DH10Bac大肠杆菌中，37℃培养48小时。可以选择pFastBac1-EGFP (D2802)作为对照质粒，可以选购DH10Bac甘油菌(D0346)用于制备感受态细胞。转化后利用蓝白斑筛选重组菌株。重组菌株由于转座会导致LacZ基因的破坏而呈现白斑，用于蓝白斑筛选的LB琼脂糖平板应含有50μg/ml卡那霉素，7μg/ml庆大霉素，10μg/ml四环素，40μg/ml X-gal和40μg/ml IPTG。
(3)选做：挑取白斑，重新划线以确认获得的白色克隆是真实的白斑。平板含有50μg/ml卡那霉素，7μg/ml庆大霉素，10μg/ml四环素，40μg/ml X-gal和40μg/ml IPTG，37℃培养过夜。
(4)挑取白斑，培养过夜。须使用含有50μg/ml卡那霉素，7μg/ml庆大霉素和10μg/ml四环素的LB培养液。
(5)小量抽提试剂盒提取重组bacmid DNA。推荐使用杆状病毒穿梭载体bacmid小量提取试剂盒(D0031)提取重组bacmid DNA。重组Bacmid DNA应该分装冻存于-20℃，因为反复冻融会导致bacmid断裂等从而显著降低其转化效率。如两星期内使用，可保存于4℃。
(6) 重组bacmid的PCR鉴定。利用 PCR反应对阳性克隆进行进一步的验证。PCR 反应所用引物为pUC/M13 forward primer (5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3')，和pUC/M13 reverse primer (5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3')。没有发生转座的bacmid其所扩增所产生的片段长度为350bp，重组bacmid扩增所产生的片段的长度为350bp加上插入片段的长度。
(7)重组bacmid转染昆虫细胞。推荐使用生产的昆虫转染试剂LipoInsect™ (C0551)，将提取的重组Bacmid转染进入昆虫细胞。建议使用Grace's Insect Cell Culture Medium培养液进行转染，转染时如果使用的昆虫转染试剂LipoInsect™，实验步骤请严格按照其说明书进行。转染后，28℃培养24小时，细胞和细胞核开始变大；转染后24-72小时，细胞慢慢停止生长、脱落，细胞表面长出芽孢状结构；转染后72小时候细胞开始裂解，此时病毒开始释放到培养液中。如果同时转染了pFastBac1-EGFP (D2802)，在转染72小时后可以观察到大部分细胞呈现绿色荧光，转染后96小时几乎所有的细胞都呈现绿色荧光，这样可以作为整个病毒包装体系的阳性对照。
(8)收集P1代杆状病毒。转染96小时后，收集培养液上清，500g离心5分钟以沉淀细胞和细胞碎片，取上清即为P1代杆状病毒。此时病毒滴度通常为1X106-1X107pfu/ml。P1代病毒可短期保存于4℃，或分装于含2% FBS的培养液中后在-80℃较长期保存。反复冻融会大大降低病毒活力，其滴度有可能降低10至100倍。
(9)P1代杆状病毒的扩增。P1代病毒再次感染昆虫细胞可获得P2代病毒。如果采用悬浮培养的昆虫细胞进行病毒扩增，建议使用10ml培养液并且控制细胞密度为2X106/ml；如果使用6孔板贴壁培养的细胞进行扩增，细胞密度应为2X106/well，MOI (multiplicity of infection)为0.05-0.1(即每100个细胞用5-10pfu的病毒进行感染)。28℃培养48-72小时后，70-80%的细胞死亡时，收集细胞和上清，500g离心5分钟，取上清即为P2代病毒。此时病毒滴度约为1X107-1X108pfu/ml。可收集本步骤离心后的细胞碎片沉淀，加入适量的1X SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(P0015A)，裂解后进行SDS-PAGE凝胶电泳及Western blot检测，以分析确定目的蛋白是否已经正常表达。
(10)选做：P2代杆状病毒的扩增。如果P2代病毒滴度仍然偏低，可对P2代病毒再次进行扩增，扩增方法同P2代病毒的扩增方法。P2代病毒感染昆虫细胞后最终会获得滴度更高的P3代病毒。
(11)病毒感染昆虫细胞进行目的蛋白的大规模表达。可选择Sf9/Sf1/HighFive的任何一种细胞株进行蛋白大规模表达。但如果表达的是分泌蛋白，建议选用HighFive。建议在昆虫细胞的对数生长期进行病毒感染，此时细胞密度在1X106/ml -2X106/ml为佳，MOI可从5-10开始尝试。建议在不同的时间阶段，如感染后24、48、72或96小时收集细胞，裂解细胞，SDS-PAGE并进行Western Blot检测以确定最佳的停止蛋白表达的时间。因为昆虫细胞内有很多蛋白酶，表达时间过长会导致目的蛋白的降解。分泌蛋白的表达高峰通常在感染后30-72小时，而非分泌蛋白的表达高峰通常在感染后48-96小时。
5. 目的蛋白的纯化
利用pFastBac1进行目的蛋白的表达的时候，根据蛋白纯化方式的需要以及融合表达目的蛋白以提高其表达量的需要，可以在质粒构建时添加His标签或GST标签。为了防止额外添加的His和GST等蛋白标签影响目的蛋白的生物学功能和结构研究，可在融合蛋白和标签之间添加蛋白酶酶切位点，如TEV或PreScission的酶切位点。昆虫表达蛋白的纯化步骤和大肠杆菌表达蛋白的纯化步骤基本一致。如果蛋白主要以可溶形式表达，离心收集昆虫细胞，超声裂解细胞，但由于昆虫细胞内蛋白酶种类比较多，需要添加各种蛋白酶抑制剂。离心收集超声后上清，使用镍柱或GST柱等纯化目的蛋白。推荐使用BeyoGold™ His-tag Purification Resin (P2210/P2218/P2220)进行His标签蛋白的纯化，推荐使用BeyoGold™ GST-tag Purification Resin(P2250/P2251/P2253/P2255) 进行GST标签蛋白的纯化，同时可以利用离子交换、分子筛层析等进一步纯化目的蛋白。可以使用PreScission Protease (P2302/P2303)或者TEV Protease (P2307/P2308)进行柱上酶切或者洗脱后酶切(如果使用TEV Protease，我们推荐使用洗脱后酶切)以取代蛋白标签。纯化获得的蛋白，可以添加适量甘油后保存，或者如果有需要也可以适当浓缩后保存等。​