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发布时间：2023/11/17 10:47:27 阅读次数：128
分光光度法 50 管/24 样
注 意 ：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
乳酸是生物体代谢过程中重要的中间产物，与糖代谢、脂类代谢、蛋白质代谢及细胞内能量
代谢密切相关，乳酸含量是评估糖元代谢的和有氧代谢的重要指标。
测定原理：
乳酸在乳酸脱氢酶的作用下生成丙酮酸，同时使NAD+还原生成NADH 和H+，H+传递给PMS
生成的 PMSH2 还原 INT 生成红色物质，在 530nm 处有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器：
天平、研钵、离心机、可见分光光度计、1 mL 玻璃比色皿、恒温水浴锅。
试剂组成和配制：
提取液：液体 55mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体 12mL×1 瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1 支，-20℃避光保存。临用前加入 1.5mL 蒸馏水充分溶解。
试剂四：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加 15mL 蒸馏水充分溶解。
试剂五：粉剂×1 支，4℃避光保存。标准品：液体 1mL×1 支，4℃保存。
显色液：临用前根据用量按照提取液（V）：试剂三（V）：试剂四（V）：试剂五（m）=1（mL)： 0.3（mL)：3（mL)：15（mg）的比例充分混匀。（注意：现配现用，用多少配多少，在棕色瓶中配制，试剂盒中带有 5 个棕色空瓶）
样本处理：
1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g，加入 1mL
提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于 4℃，12000g 离心 10min，取上清测定。
2. 细胞：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；于 4℃，12000g 离心 10min，取上清测定。
3. 血清：直接测定。
测定操作：
|
| 样品对照管 | 样品测定管 | 标准对照管 | 标准测定管 |
| 样品（μL） | 50 | 50 |
|
|
| 标准品（μL） |
|
| 50 | 50 |
| H2O（μL） | 300 | 450 | 300 | 450 |
| 试剂一（μL） | 150 |
| 150 |
|
| 试剂二（μL） | 200 | 200 | 200 | 200 |
| 显色液（μL） | 300 | 300 | 300 | 300 |
充分混匀，于 37℃反应 30min，于 1mL 玻璃比色皿，蒸馏水调零，测定 530nm
处吸光值，分别记为 A1，A2，A3，A4，△A 样=A2-A1；△A 标= A4-A3
注 意：标准对照管和标准测定管只需测定一次，每个样品测定管设一个样品对照管
计算公式：
1.按照蛋白含量计算：
LA 含量（μmol/mg prot）=△A 样÷△A 标×C 标÷ Cpr
=2×△A 样÷△A 标÷ Cpr
乳酸含量（lactic acid，LA）试剂盒说明书
2.按照样本质量计算
LA 含量（μmol/g 鲜重）=△A 样÷△A 标×C 标÷ W
=2×△A 样÷△A 标÷ W
3.按照细胞数量计算
LA 含量（μmol/104 cell）=△A 样÷△A 标×C 标÷ 细胞数量
=2×△A 样÷△A 标÷ 细胞数量
4.按照液体体积计算
LA 含量（μmol/mL）=△A 样÷△A 标×C 标
=2×△A 样÷△A 标
C 标：标准品浓度，2mmol/L ；W：样本质量，g/mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL
注意事项：
1.若吸光值超过 2，请进行适当的稀释后再进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。
2.最低检出限为 1.8μmol/L。
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