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发布时间：2021/12/8 9:29:53 阅读次数：1152
.全细胞分析法（薄层层析法）
（1）材料：①微晶纤维（Cellulose microcrystalline）；②层析缸：21cm x 6cm；③普通玻璃板：20cm X 5 cm；④标准氨基酸,糖.
（2）方法：
1）制板：把玻璃板洗净,取微晶纤维每g加蒸馏水3.5ml（置三角瓶中）调成均匀糊状；在玻璃板上涂成薄层,每个板约微晶纤维1.2-1.5 g,风干,不需要活化,即可使用 .
2）用菌株生长的液体培养基,分装于20 cm X 2 cm试管中,每管8ml.灭菌后接种并在摇床培养3～5天后,过滤培养液,用蒸馏水冲洗菌体两次,再用无水乙醇冲洗两次.取经上述处理过的混菌体30mg装于硬质玻璃管内（0.9 cm X 12 cm）,用于氨基酸分析,另取30mg用于糖组份分析.
3）菌体水解；在做氨基酸分析的玻璃管中放入6N HCl 0.1ml.在做糖分析的玻璃管中加入0.5N HCl 0.1ml,火焰封口,放入烘箱, 温度上升120℃后,再持续15 min取出.用于氨基酸分析的水解液以黑褐色为宜,用于糖分析的水解液以黄棕色为宜.
4）点样：用微量进样器抽取0.4μl氨基酸水解液点在薄板距下缘1 cm处,并点0.01 mol D,L-DAP,同时点含有L,L-DAP, meso-DAP和D-DAP的 标准氨基酸混合液,以及天门冬氨酸,甘氨酸,谷氨酸,丙氨酸0.2 μl标准样.取另一薄板,以相同方法点含有1％鼠李糖,核糖,木糖,阿拉伯糖,甘露糖,葡萄糖和半乳糖的混合液0.2μ1作为标准样.
5）展层剂：氨基酸分析：甲醇：吡啶：冰乙酸：水（10:1:0.25:5）；糖分析：乙酸乙酷：吡啶：冰乙酸（8:5:1.5）.
6）展层：点好的薄板直接放入层析缸中,不需要饱和,层析时间约3h.
7）显色：氨基酸分析：用0.4％莉三酮（水饱和正丁醇）；糖分析：用苯胺,邻苯二甲酸.
以上分别喷显色剂显色：置100-110℃,2-5min,显出颜色.核糖 木糖和阿拉伯糖显色后呈粉红色,其他糖呈褐黄色.
2.纯细胞分析（薄层层析法）
（1）材料：同全细胞分析法.
（2）方法：
1）制板：同全细胞分析法
2）菌体收集：取10 g对数后期湿菌体（不得用于菌体或开始自溶的菌体,也不要在室温下保存的菌体,如需保存应把菌体保存在冰冻状态下）,悬浮于30-40ml,0.1 mol/L pH8.0磷酸缓冲液中,用超声波破菌体,菌体破碎后,先用3000r/min离心3 min除去未破碎的菌体,上清液再以15000-16000 r/min离心,得到破碎的细胞壁.当菌体的全细胞糖型为A（含半乳糖和阿拉伯糖）的菌较难破碎也较难沉淀,可适当延长破碎和离心时间.这样得到的细胞壁沉淀物用pH 8.0的磷酸缓冲液,95％的乙醇分别清洗二次,然后在2％的乙醇KOH溶液（2 g KOH溶于100 ml 95％乙醇中）中皂化（37℃振荡2～3天）,再用95％乙醇,蒸馏水分别清洗二次,再用过滤过的含胰蛋白酶的pHS.O磷酸缓冲液（缓冲液中含胰蛋酶3 mg/ml）处理粗制细胞壁（37℃振荡2h）,用pH S.O磷酸缓液,蒸馏水各清洗二次,清洗后的沉淀物再用胃蛋白酶的盐酸溶液（3 mg/ ml 0.02N HCI）处理（37℃振荡过夜）.然后再0.02N HCI 蒸馏水 乙醇分别清洗2次,最后用氯仿清洗一次,得纯细胞壁.
3）菌体水解：同全细胞分析法
4）点样：同全细胞分析法
5）展层法：氨基酸分析：甲醇：吡啶：冰乙酸：水（10:0.5:0.125:2.5）；糖分析：同细胞壁分析法.
6）显色剂及显色：同全细胞分析.
本文节选自《常见细菌系统鉴定手册》第十四章
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