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发布时间：2024/7/1 9:44:15 阅读次数：165
人转移胰腺腺癌细胞吉西他滨耐药株（ASPC-1/GEM）
细胞介绍
一个胰腺癌病人的腹水中的细胞移植到裸鼠后建立了这个细胞株.
细胞特性
1） 来源：ASPC-1耐药筛选
2） 形态：上皮细胞样,贴壁生长
3） 含量：>1×106 细胞数
4） 用途：仅供科研使用
细胞运输 保存及注意事项
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| 复苏细胞 | 冻存细胞 |
| 包装 | 充液的T25细胞培养瓶 | 1mL冻存管 |
| 运输条件 | 常温 | 干冰 |
| 保存方式 | 75%酒精消毒瓶壁,置于37℃恒温细胞培养箱 | -80℃冰箱中保存过夜后转入液氮/立即复苏 |
| 注意事项 | 1. 收到细胞请先就培养瓶/冻存管的外观 细胞的状态,进行拍照并保存,如有问题请及时联系我们； 2. 收到的复苏细胞,若有较多细胞飘起,可能由于运输导致.请先置于37℃细胞培养箱中静置2~4h,待细胞贴壁后再做处理； 3. 复苏细胞充液培养基为不含药物的维持培养基,收到细胞后请及时更换为完全培养基； 4. 建议收到细胞后,首先进行扩增,并冻存部分细胞以备用. | |
细胞耐药诱导过程
待细胞生长稳定后,开始倍增药物诱导剂量,每个剂量保持至细胞可以稳定生长至汇合度达50%以上.递增药物浓度依次为：0.03μg/mL 0.3μg/mL 1.5μg/mL 3μg/mL 6μg/mL 12μg/mL 18μg/mL.约10个月后,细胞可在18μg/mL GEM药物浓度下稳定生长,视为耐药细胞株构建成功,并命名为ASPC-1/GEM.
细胞培养试剂的配制
1）GEM药物的配制及保存
建议将GEM药物配制成18mg/mL的母液：即使用1mL DMSO溶液溶解18mg GEM药物,使其完全溶解.
注意：可根据用量配置药物,并将药物分装保存,避免反复冻融导致药物失效.溶解后的GEM,4℃保存1周,-20℃保存1个月,-80℃保存6个月.
2）冻存液的配制
90%优质胎牛血清+10%DMSO,现用现配.
3）完全培养基的配制（推荐使用h005-001b）
| 成分 | 体积/浓度 |
| 优质胎牛血清 | 10% |
| 双抗 | 1% |
| GlutaMAX-1谷氨酰胺 | 1% |
| GEM | 0~18μg/mL |
| DMEM培养基 | 补充至所需体积 |
细胞培养条件
气相：空气,95%；二氧化碳,5%；温度：37℃,培养箱湿度为70%~80%.
细胞处理
1）冻存细胞的复苏
将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入到含4~6mL完全培养基的离心管中混合均匀,1000rpm/min离心3~5min,弃去上清液.加入1mL完全培养基重悬细胞后,均匀铺于含6~8mL完全培养基的培养瓶（或皿）中,置于37℃恒温细胞培养箱中过夜培养.第二天显微镜下观察细胞生长情况,2~3day换液.
注意：①细胞复苏过程中,不可使用含有药物的培养基.须在细胞完全贴壁,形态完全展开,生长状态稳定后,方可根据实验需要添加GEM药物.若加药后细胞生长状态较为缓慢,可适当降低GEM的浓度,或使用不含GEM的完全培养基培养至细胞生长状态较好时,再更换为所需的GEM浓度；
②建议复苏细胞时始终穿戴防护手套和面罩,避免冻存管因温差较大而发生爆炸,造成人员伤害.
2）细胞传代（建议以同等底面积的培养瓶/皿按照1：2比例传代）
①待细胞密度达到80%~90%时,即可进行传代培养.
②弃去培养上清,用不含钙 镁离子的PBS润洗细胞1次,吸净残余的PBS.
③加入适当体积的0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶-1mL,其它培养器皿可覆盖培养底面即可）,置于37℃培养箱中消化2~5min,显微镜下观察细胞细胞大部分变圆并脱落,即可轻拍培养瓶使细胞全部脱落.迅速拿回操作台,加入2倍体积的 含10%FBS的培养基中止消化.
④将细胞悬液移入离心管中,1000rpm/min离心5min,弃去上清液.
⑤向细胞沉淀中加入1~2mL完全培养基重悬细胞,轻吹混匀.将细胞悬液按1：1的比例均匀铺于2个新的培养瓶/皿中,添加6~8mL完全培养基,置于37℃恒温细胞培养箱中培养.第二天显微镜下观察细胞生长情况,2~3day换液.
注意：细胞传代过程中,不可使用含有药物的培养基.须在细胞完全贴壁,形态完全展开,生长状态稳定后,方可根据实验需要添加GEM药物.若加药后细胞生长状态较为缓慢,可适当降低GEM的浓度,或使用不含GEM的完全培养基培养至细胞生长状态较好时,再更换为所需的GEM浓度.
3）细胞冻存
①细胞冻存时,步骤同2）细胞传代的①~④,细胞计数后,加入配制好的细胞冻存液,重悬细胞,按照1×106 ~ 1×107个细胞/mL分配到一个冻存管中,标注好名称 代数 日期等信息.
②将要冻存的细胞置于程序降温盒中,-80℃冰箱中过夜,之后转入液氮容器中储存.同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用.
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