M-MuLV反转录酶（RNase H-）

英文名称：RNase H minus
产品编号：D7159
产品类别：普通PCR检测试剂盒
检测样本：RNA

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2000U

￥ 527 200

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y MuLV反转录酶(RNase H-)，即 M-MuLV Reverse Transcriptase(RNase H minus)是一种经过改造和优化的M-MuLV反转录酶(RNase H-)。和普通的M-MuLV反转录酶相比， M-MuLV反转录酶(RNase H-)也是一种依赖于RNA或DNA模板的DNA聚合酶，可以以RNA或DNA为模板在引物存在的情况下完成互补DNA链的合成；但缺失了Ribonuclease H(RNase H)酶活性，不能够选择性剪切RNA和DNA杂合双链中的RNA。 M-MuLV反转录酶(RNase

H-)是最常用的反转录酶之一。
特点：-MuLV反转录酶(RNase H-)可以合成长达13kb的cDNA，而普通的M-MuLV反转录酶(RNase H-)仅能合成长达9kb的cDNA； M-MuLV反转录酶(RNase H-)的最适反应温度为42-45℃并且在55℃时仍然有很高活性，可以避免普通的M-MuLV反转录酶(RNase H-)在37℃反应时的一些不足。
用途：M-MuLV反转录酶(RNase H-)常用于在获得总RNA或mRNA后cDNA第一条链的合成。 M-MuLV反转录酶(RNase H-)合成的cDNA第一条链后续可以用于PCR、real-time PCR、cDNA第二条链的合成等。
M-MuLV反转录酶(RNase H-)也可以用于DNA探针的标记，通过引物延伸(primer extention)来分析RNA，以及用于基因芯片荧光探针的标记。
来源：本 M-MuLV反转录酶(RNase H-)由大肠杆菌表达，表达的基因为经过突变优化的编码Moloney Murine
Leukemia Virus reverse transcriptase的pol基因片段。
活性定义：One unit of the enzyme incorporates 1 nmol of dTMP into a polynucleotide fraction in 10 min at 37℃. Enzyme activity is assayed in 50 mM Tris-HCl(pH 8.3), 6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 40 mM KCl, 0.5 mM dTTP, 0.4 MBq/ml [3H]-dTTP, 0.4 mM polyA·oligo(dT)12-18。
纯度：不含DNA内切酶、外切酶和磷酸酯酶和RNA酶，可以满足常规反转录合成cDNA第一条链等的需要。
酶储存溶液：50 mM Tris, pH 8.3, 100mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 0.1% Triton X-100 and 50% glycerol。
Reaction Buffer(5X)：250 mM Tris, pH 8.3 at 25℃, 250 mM KCl, 20 mM MgCl2, 50 mM DTT。
失活或抑制：70℃孵育10分钟可以导致 M-MuLV反转录酶(RNase H-)失活；EDTA、EGTA等螯合剂、无机磷酸盐或焦磷酸盐以及聚氨(polyamine)对M-MuLV反转录酶(RNase H-)有抑制作用。
本产品中M-MuLV反转录酶(RNase H-)的浓度为200U/μl，用于体积为20微升的反转录体系时足够进行10次反转录反应。
包装清单：

产品编号	产品名称	包装
D7159-1	M-MuLV反转录酶(RNase H-)	2000U
D7159-2	Reaction Buffer(5X)	0.2ml
－	说明书	1份

保存条件：
-20℃保存。
注意事项：
对于GC含量比较高的RNA的反转录，试剂盒的使用说明中给予了特别说明，请予以关注。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1. cDNA第一条链的合成(First-strand cDNA Synthesi)：
a. 参考如下表格设置反转录反应：

模板(后面3种任选一种)	Total RNA	0.01-5μg
	或Poly(A) RNA/mRNA	1-500ng
	或Specific RNA	0.01pg-500ng
引物(后面3种任选一种)	Oligo(dT)18	0.5μg (或100pmol)
	random hexamer	0.2μg (或100pmol)
	Gene specific primer	15-25pmol
DEPC-treated Water	－	To 13.7μl*
Reaction Buffer (5X)	－	4μl
RNase Inhibitor	－	0.5μl**
dNTP Mix (25 mM each)	－	0.8μl ***
M-MuLV反转录酶(RNase H-)	－	1μl
总体积		20μl

To 13.7μl表示加入DEPC-treated Water至最终体积为13.7μl。注意：对于GC含量比较高的RNA模板的反转录反应，加入DEPC-treated Water混匀后微离心，接着可以在65℃孵育5分钟，随后立即置于冰浴以打开RNA的一些比较稳定的二级结构。
RNase Inhibitor可以视其本身的情况加入适当的量，例如0.5μl或其他适当体积。在加入其他体积时，DEPC-treated Water的用量需适当调整。
dNTP浓度不同时使用的体积需作适当调整，此时DEPC-treated Water的用量需适当调整。
b. 轻轻混匀(可以用Vortex在最低速度轻轻混匀或用移液器吹打混匀)，随后离心沉淀液体。
c. 如果使用Oligo(dT)18作为引物或使用基因特异性引物，在42℃孵育60分钟。如果使用rando mhexamer(随机六聚体)作为引物，先在25℃孵育10分钟，随后在42℃孵育60分钟。注意：对于GC含量比较高的RNA模板的反转录反应，可以设置为45℃孵育60分钟。
d. 70℃孵育10分钟以失活 M-MuLV反转录酶(RNase H-)并终止反转录反应。说明：对于长片段的cDNA不推荐采用加热的方法失活 M-MuLV反转录酶(RNase H-)，这种操作可能会导致部分长片段 DNA被剪切。
e. 反转录产物可以直接用于后续的PCR等反应，也可以-20℃冻存以备以后使用。用于后续PCR反应时，如果PCR的反应体系为 50微升，则推荐使用2微升反转录产物。
2. 其他用途请自行参考M-MuLV反转录酶(RNase H-)的相关文献资料进行。
常见问题：
1. 总RNA反转录产物电泳观察不到。
反转录产物由于是从模板反转录而获得，而模板的量本身比较低，反转录的量通常还要少于模板量，因此通常总RNA的反转录产物直接电泳观察是观察不到的。
2. 反转录产物通过PCR扩增没有特异性条带。
PCR扩增没有获得特异性条带时建议先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增，看是否可以成功扩增。如果可以成功，则说明PCR扩增体系没有问题，此时通常是目的基因的引物设计欠佳，当然也有可能是反转录产物质量欠佳。如果内参不能被很好地扩增，则有可能PCR体系存在问题或反转录产物质量欠佳。