III M-MLV反转录酶

  III M-MLV反转录酶，即 III M-MLV reverse transcriptase，是一种经过改造和优化的快速高效(短至10min完成反转录)、热稳定(高达55℃)、高精确度、产物超长(长达12kb)的反转录酶，具有正常的依赖于RNA或DNA模板的DNA聚合酶活性，能够以RNA或DNA为模板，在引物存在的情况下进行互补DNA链的合成，即可以进行cDNA(complementary DNA)的第一链合成。同时本反转录酶保留了RNase H活性，能选择性剪切RNA和DNA杂合双链中的RNA，有利于后续cDNA第二链的合成。

本产品是最常用的优质反转录酶之一，广泛用于获得总RNA或mRNA后cDNA第一条链的合成，后续可以用于PCR、real-time PCR也称定量PCR(quantitative PCR, qPCR)、cDNA的第二链合成以及cDNA文库的构建，尤其是逆转录所得目的基因的克隆等。 III M-MLV反转录酶还可以通过反转录用于DNA探针的荧光、生物素、地高辛或同位素标记等，也可以通过引物延伸(primer extension)来分析和研究RNA。
M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus)，也称MMLV或M-MuLV；反转录酶(reverse transcriptase)也称逆转录酶或RT酶。
本产品反转录快速高效，普通反转录仅需10min。实测小于3kb的片段，42℃反转录10min即可完成，与反转录60min相比无显著差别。大于3kb的片段，特别是大于6kb的片段，推荐反转录60min，以获得最佳的反转录效果。
本产品反转录产物长度超长。本产品经测试可以轻松完成长度为8 kb以下基因的反转录(参考图1)，反转录的最大长度可以达到12 kb。

图1. 使用 III M-MLV反转录酶反转录总RNA后，对于不同长度的cDNA进行PCR扩增后的电泳效果图。图中可见0.2-12kb的cDNA可以非常高效地被反转录。

本产品热稳定性好，反转录效率高。本产品最适反应温度为42℃，当温度达到50℃时仍具有很高活性，对于长度较短的cDNA反转录，温度达到55℃时也可获得较高产量的cDNA。高温反转录对于高GC含量RNA的反转录，能有效减少二级结构，提升反转录效率。本产品反转录速度快，6kb以下的cDNA反转录只需0.5h即可完成，3kb以下的cDNA反转录10min即可完成(参考图2)。

图2. BIII M-MLV反转录酶在不同温度反应不同时间的反转录效果。从HEK293T细胞抽提获得的总RNA 2µg，在20μl反转录体系中按照图中所示温度、时间进行反转录。反转录后取1μl反转录产物进行目的基因(2.6kb的YWHAZ基因和6.0kb的ADAR1基因)的PCR扩增和电泳。

本产品性价比高。III M-MLV反转录酶是一种大肠杆菌重组高表达的反转录酶，由于其表达量非常高，大大提高了本产品的性价比。本反转录酶为表达含有从Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase基因克隆的pol基因，并进行了多个突变优化以提高其热稳定性、反转录效率、反转录长度和表达量。
酶活性定义：One unit of the enzyme incorporates 1 nmol of dTTP into acid-precipitable material in 10 min at 37℃ using poly(A)•oligo(dT)12-18 as template-primer。反应体系为 50 mM Tris-HCl(pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0.5mM [3H]-dTTP and 0.4 mM polyA•oligo(dT)12-18。
纯度：不含DNA内切酶、外切酶和磷酸酯酶和RNA酶，可以满足常规反转录合成cDNA第一条链等的需要。
酶储存溶液：20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.01%(v/v)
NP-40 and 50%(v/v) glycerol。
失活或抑制：80℃孵育10分钟可以导致 III M-MLV反转录酶失活；EDTA、EGTA等螯合剂、无机磷酸盐或焦磷酸盐以及聚氨(polyamine)对 III M-MLV反转录酶有抑制作用。
本产品中M-MLV反转录酶的浓度为200U/µl，用于体积为20μl的反转录体系时，本试剂盒的不同包装足够分别进行50次、250次和1000次反转录反应。
包装清单：

保存条件：
-20℃保存。
注意事项： 
对于GC含量比较高的RNA的反转录，产品的使用说明中给予了特别说明，请予以关注。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1. cDNA第一条链的合成(First-stand cDNA Synthesis)：
a. 参考如下表格中设置的20μl反转录体系(RNase Inhibitor (R0102)和dNTP mix (D7373)可从订购)：

*To 13.7μl表示加入DEPC-treated Water至最终体积为13.7μl。
**dNTP浓度不同时使用的体积需作适当调整，此时DEPC-treated Water的用量需适当调整。
b. 轻轻混匀(用移液器轻轻吹打混匀或用涡旋混合器在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
c. 如果使用Oligo(dT)18或基因特异性引物，42℃孵育10-60 min。如果使用random hexamer(随机六聚体)作为引物，先在25℃孵育10 min，随后在42℃孵育10-60 min。反转录3kb以下的cDNA，反转录10min即可，反转录3-6kb的cDNA，反转录30min即可，而6kb以上的cDNA推荐反转录60min。当使用random hexamer(随机六聚体)作为引物，并且后续用于qPCR时，后续检测任何长度的基因，均反转录10min就足够了。注意：对于GC含量较高或二级结构比较严重的模板RNA，可以50℃孵育60min，以充分利用本产品在50℃时仍有良好的反转录酶活性这一特点，在较高温度进行反转录可以有效减少二级结构的干扰。
d. 80℃孵育10 min以失活 III M-MLV反转录酶并终止反转录反应。说明：对于5kb以上的长片断cDNA不推荐采用加热的方法失活反转录酶，该方法易导致部分长片断DNA被剪切，此时可考虑酚氯仿抽提或柱纯化方法。
e. 反转录产物可以直接用于后续的PCR反应等，也可以-20℃冻存以备以后使用。用于后续PCR反应时，如果PCR的反应体系为20μl和50μl，则推荐相应地使用0.8μl和2μl反转录产物。
2. 引物延伸、探针标记等其它用途请自行参考M-MLV反转录酶的相关文献资料进行。

常见问题：
1. 总RNA反转录产物电泳观察不到。
a. 反转录产物由于是从模板反转录而获得，而模板的量本身比较低，反转录的量通常还要少于模板量，并且总RNA的反转录产物大小很不均匀，因此通常总RNA的反转录产物直接电泳观察是观察不到的。
2. 反转录产物通过PCR扩增没有特异性条带。
a. PCR扩增没有获得特异性条带时建议先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增，看是否可以成功扩增。如果可以成功，则说明PCR扩增体系没有问题，此时通常是目的基因的引物设计欠佳，当然也有可能是反转录产物质量欠佳。如果内参不能被很好地扩增，则有可能PCR体系存在问题或反转录产物质量欠佳。
b. 模板RNA发生了降解。哺乳动物细胞或组织的总RNA琼脂糖电泳后应该可以看到清晰的18S和28S rRNA条带，并且28S rRNA和18S rRNA的亮度比例应该大于等于2.0。如果比例小于2.0，则提示总RNA发生了显著的降解，最好能重新制备总RNA样品。避免RNA降解的主要方法是，严格进行RNA的相关操作，包括带洁净手套、戴一次性口罩、在洁净环境中抽提或制备RNA，以尽量避免RNase污染。
c. 模板RNA的纯度偏低。在提取纯化RNA的过程中，残留在溶液中的一些成分如苯酚、SDS、EDTA、胍盐、磷酸、焦磷酸、多胺、亚精胺等会抑制反转录酶活性。对RNA样品进行柱纯化，或者进行沉淀、洗涤和再溶解，通常可以有效去除残留的污染物。通常选择使用BeyoZol或Trizol抽提获得的总RNA完全可以满足反转录反应的需要。
d. 反转录反应的模板量不足。在抽提获得总RNA后，在进行一些精细的定量检测时通常会进行DNase I消化，以充分去除可能的残留的DNA的干扰。DNase I进行热失活时，需要加入EDTA至终浓度为2.5mM，否则RNA在没有螯合剂的情况下，在加热过程中容易被水解，从而导致模板量不足。此外，扩增特定基因时，需要先查询该基因的组织分布特点，利用其高表达的组织进行目的基因的反转录和克隆。用该基因丰度极低的组织或细胞样品进行反转录和PCR扩增，通常会由于模板量过少而PCR扩增失败。
e. 没有使用适当的反转录引物。对于细菌RNA和不含poly(A)尾巴的RNA，要用random hexamer引物代替Oligo(dT)18引物。使用基因特异性反转录引物时，需要确保基因特异性引物设计合理正确。
f. 如果RNA模板富含GC或容易形成二级结构，此时可以考虑把反转录温度提高到45-55℃

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