试验前请仔细阅读说明书，本产品仅供科研实验使用。
1. 所购产品均质量保证！
2. 试剂盒方面提供技术指导，Elisa试剂盒还可以提供代检测服务。
3.本公司出售的任何产品均保质保量，除以下情况，客户可联系我公司申请退换货售后服务
以下情况不予办理退换货：
1、已超过受理期限的产品，如过保质期。
2、由于客户自身操作原因导致实验失败。
3、由于客户没有仔细确认要订购的指标，导致自己的指标定错。
4、产品已使用（质量问题除外）。
EMSA/Gel-Shift试剂盒(EMSA/Gel-Shift Kit)是用于EMSA(也称gel shift)研究的一个试剂盒。通过EMSA可以研究目的蛋白和特定的DNA序列的结合情况，从而可以研究细胞内一些转录因子的激活水平。本试剂盒提供了进行EMSA实验的探针标记、蛋白和DNA结合以及EMSA上样等的主要试剂，使EMSA实验变得简单方便。
EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)中含有poly(dI-dC)等有效成分。其中poly(dI-dC)的浓度经过优化，可以很好的消除蛋白和标记探针间的非特异性结合，同时又不会减弱目的转录因子和标记探针间的结合。
每个EMSA/Gel-Shift试剂盒足够标记10-20次探针，足够进行100个蛋白和探针的结合反应。
包装清单：
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| GS002-1 | T4 Polynucleotide Kinase | 100U |
| GS002-2 | T4 Polynucleotide Kinase Buffer(10X) | 100μl |
| GS002-3 | Nuclease-Free Water | 1ml |
| GS002-4 | 探针标记终止液 | 100μl |
| GS002-5 | 5M 醋酸铵 | 600μl |
| GS002-6 | EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) | 200μl |
| GS002-7 | EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色，10X) | 200μl |
| GS002-8 | EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X) | 200μl |
| GS002-9 | TE | 1ml/管，共2管 |
| — | 说明书 | 1份 |
保存条件：
-20℃保存，一年有效。
注意事项：
需自备待标记的EMSA探针，需自备用于探针标记的同位素，需自备EMSA胶配制的相关试剂。
细胞核蛋白的抽提可以使用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。
如需做super-shift，需自备用于super-shift的抗体。
本实验涉及到同位素的操作，请严格按照同位素的相关管理条例进行操作。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明：
1. 探针的标记：
(1)如下设置探针标记的反应体系：
| 待标记探针(1.75pmol/μl) | 2μl |
| T4 Polynucleotide Kinase Buffer(10X) | 1μl |
| Nuclease-Free Water | 5μl |
| [γ-32P]ATP(3,000Ci/mmol at 10mCi/ml) | 1μl |
| T4 Polynucleotide Kinase(5-10u/μl) | 1μl |
| 总体积 | 10μl |
按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4Polynucleotide Kinase，混匀。
(2)使用水浴或PCR仪，37℃反应10分钟。
(3)加入1微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。
(4)再加入89微升TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上，即总放射性的30%以上标记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。
(5)标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。
2. 探针的纯化：
通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化，可以按照如下步骤操作：
(1)对于100微升标记好的探针，加入1/4体积即25微升的5M醋酸铵，再加入2体积即200微升的无水乙醇，混匀。
(2)在-70℃至-80℃沉淀1小时，或在-20℃沉淀过夜。
(3)在4℃，12,000g-16,000g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉淀。
(4)在4℃，12,000g-16,000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。
(5)加入100微升TE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。
3. EMSA胶的配制：
(1)准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大EMSA胶的模具。
(2)按照如下配方配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。
| TBE buffer(10X) | 1ml |
| 重蒸水 | 16.2ml |
| 39:1 acrylamide/bisacrylamide(40%,w/v) | 2 |
| 80% 甘油 | 625μl |
| 10% 过硫酸铵(ammonium persulfate) | 150μl |
| TEMED | 10μl |
(3)按照上述次序加入各个溶液，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡，并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。
4. EMSA结合反应：
(1)如下设置EMSA结合反应(预期的结果参见图1)：
| 阴性对照反应： | |
| Nuclease-Free Water | 7μl |
| EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) | 2μl |
| 细胞核蛋白或纯化的转录因子 | 0μl |
| 标记好的探针 | 1μl |
| 总体积 | 10μl |
| 样品反应： | |
| Nuclease-Free Water | 5μl |
| EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) | 2μl |
| 细胞核蛋白或纯化的转录因子 | 2μl |
| 标记好的探针 | 1μl |
| 总体积 | 10μl |
| 探针冷竞争反应： | |
| Nuclease-Free Water | 4μl |
| EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) | 2μl |
| 细胞核蛋白或纯化的转录因子 | 2μl |
| 未标记的探针 | 1μl |
| 标记好的探针 | 1μl |
| 总体积 | 10μl |
| 突变探针的冷竞争反应： | |
| Nuclease-Free Water | 4μl |
| EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) | 2μl |
| 细胞核蛋白或纯化的转录因子 | 2μl |
| 未标记的突变探针 | 1μl |
| 标记好的探针 | 1μl |
| 总体积 | 10μl |
| Super-shift反应： | |
| Nuclease-Free Water | 4μl |
| EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) | 2μl |
| 细胞核蛋白或纯化的转录因子 | 2μl |
| 目的蛋白特异抗体 | 1μl |
| 标记好的探针 | 1μl |
| 总体积 | 10μl |
(2)按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温（20-25℃）放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温(20-25℃)放置20分钟。
(3)加入1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。
注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合，建议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至能观察到蓝颜色即可。
5. 电泳分析：
(1)用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的1X的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行。
(2)把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10微升稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色)，用于观察电泳进行的情况。
(3)按照10V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。
(4)剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有EMSA胶的胶板，用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边缘的电压液。小心打开两块胶板中的上面一块(注：通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板)，把滤纸从EMSA胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA胶，轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后(大约不足1分钟)，轻轻揭起滤纸，这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下，放平，在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜，确保保鲜膜和胶之间没有气泡。
(5)在干胶仪器上干燥EMSA胶。然后用X光片压片检测，或用其它适当仪器设备检测。EMSA的典型分析结果可以参见下面的图1。
图1.一个典型的EMSA/Gel-Shift分析图
1,阴性对照反应(标记探针)；
2，常规反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针)；
3,探针冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针+标记探针100倍量的未标记探针)；
4,突变探针的冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针+标记探针100倍量的未标记突变探针)；
5,Super-shift反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针+目的转录因子的特异抗体)。
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