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柱式动物线粒体DNAOUT,PCR级

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  线粒体DNA(mtDNA)是进行分子进化研究和母性遗传研究的重要材料,但传统的两步式mtDNA提取方法是先温和裂解细胞,分离线粒体,然后再从线粒体中提取mtDNA。此方法中的温和裂解细胞的条件十分难以控制,需要针对不同组织材料单独进行优化。本方法克服了上述缺点,具有下列优点:

1. 不需要单独纯化线粒体,柱式法纯化,操作简单快捷。

2. 得到的mtDNA可以直接用于PCR和酶切。

3. 107个动物细胞一般能得到100ng左右的mtDNA,每克组织一般能得到3-5

μg mtDNA。

4. 注意:本产品只适合于动物材料,不适合于植物材料。

使用及效果

107个细胞或1克剪碎的组织中加入0.25 mL溶液A,吹打分散,再加入0.25 mL溶液B,匀后冰浴8分钟,加入0.35  mL溶液C后混匀12000  g离心10分钟,将上清液转移到离心吸附柱中,离心1分钟,用0.5 mL 的通用洗柱液洗两次,最后用30-50 μL DNA洗脱液将mtDNA洗脱。

 

 

用本产品从新鲜猪肝中提取mtDNA,原液稀释10000 倍后取10 μL做为PCR 模板, 分别用三对猪线粒体DNA专一性引物进行扩增, 用其中的1/2上样电泳。电泳染料为绿如蓝。

 

 

线粒体是合成ATP和脂肪酸的细胞器,每个细胞有多个线粒体,每个线粒体有多个基因组,例如每个酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞里有20多个线粒体,人淋巴细胞有数个,肝细  胞有500-2500个,卵母细胞有上千个。除少数低等真核生物线粒体基因组为线状DNA外,其他生物的线粒体基因组都是环状DNA。线粒体基因组缺乏组蛋白,故无核小体。哺乳动物的线粒体基因DNA没有内含子,几乎每一对核苷酸都参与一个基因的组成,有许多基因的序列是重叠的。不同物种的线粒体基因组的大小相差悬殊,在动物中的趋势是物种越高等,mtDNA越小,排列越紧密。下表是常见物种mtDNA的大小列表

 

 

mtDNA只有D环区(D-loop,参与复制启动)和另外87个bp不是编码基因外,其余序列共编码13个蛋白质(细胞色素b、细胞色素氧化酶的3个亚基、ATP酶的2个亚基以及NADH 脱氢酶的7个亚基)、24个rRNA(包括1个16SrRNA、1个12SrRNA和22个tRNA)。人类        的神经肌肉变性疾病如Leber氏遗传性视神经病、帕金森病、早老痴呆症、线粒体脑肌病、母系遗传的糖尿病和耳聋等都同线粒体基因有关。

高等植物mtDNA长度在100 Kb~2000  Kb之间,大部分由非编码的DNA序列组成,且有许多短的同源序列,同源序列之间的DNA重组会产生较小的亚基因组环状DNA,与完整的“主”基因   组共存于细胞内,因此植物线粒体基因组的研究更为困难。

与细胞核DNA相比mtDNA具有下列特点:①突变率高,是核DNA10-100倍左右,  有利于检查出在较短时期内基因发生的变化,有利于比较不同物种的相同基因之间的差别,确定这些物种在进化上的亲缘关系;②母性遗传(maternal   inheritance),这是由于动物精子的细胞质极少,子代mtDNA基本上都是来自卵细胞,因此具有相同mtDNA序列的个体必定是来自一位共同的雌性祖先。

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