高纯质粒小提试剂盒

 ● 试剂盒内容及保存：

● 储存条件和效期：

本试剂盒在室温（25℃左右）干燥条件下，可保存1年；更长时间的保存可置于2–8℃。2–8℃保存条件下，若溶液产生沉淀，应在使用前置于37℃下溶解沉淀至溶液澄清后再使用。单独包装的RNase A 在-20℃可稳定保存1年以上。加入RNase A后的溶液P1应置于2–8℃保存，可稳定保存半年。

● 产品简介及使用说明：

本试剂盒采用经典的碱裂解法裂解细菌，再通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合DNA的特性，可以从1–5ml大肠杆菌LB培养液中快速提取3–20μg纯净的高拷贝质粒DNA。提取的质粒可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接和转化等实验。然而，对质粒纯度要求更高的转染实验（要求无内毒素），此试剂盒不能达到要求。另外，尽管该试剂盒可以抽提较大的质粒（>10kb），但我们不推荐使用。如果一定要使用，请参考以下方法：加大菌体使用量（使用5–10 ml过夜培养物），同时按照比例增加P1、P2、P3的用量；洗脱缓冲液应在70℃预热，在吸附和洗脱时可以适当的延长时间，以增加提取效率，其它步骤相同。

● 产品特点：

1使用了Lysis Dye，菌体裂解是否完全一目了然。由于判断菌体裂解和中和是否彻底更主要取决于操作者的经验，所以我们增加了Lysis Dye（一种能使裂解/中和体系变换颜色的试剂）来帮助观察裂解/中和的程度。加入P1后，Lysis Dye使菌液变为浑浊的红色；加入P2后，Lysis Dye立即使溶液变为澄清的红色，裂解是否完全只要观察红色溶液是否澄清，如果红色非常均一，表明裂解充分；在完全裂解的体系中加入P3混匀后，体系立即变为黄色，任何红色的残留表明没有完全混匀或者中和不彻底。

2 增加了去蛋白液PD，能更加彻底地去除蛋白污染，得到纯度更高的质粒。

● 准备工作：

1 将试剂盒附带的RNase A全部加入到溶液P1中（如15ml P1中加入150μl RNase A），混匀后4℃贮存。

2 按照标签所示在漂洗液PW中加入无水乙醇，混匀后盖紧瓶盖后室温贮存备用。

3 每次使用前请检查溶液P2，溶液P3和去蛋白液PD是否有沉淀生成，如果出现沉淀，37℃温浴至沉淀溶解后再使用。

● 使用Lysis Dye的标准操作步骤：

如非指出，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

1．   取1–5 ml过夜培养的菌液加入离心管中，10,000g 离心1分钟，尽量吸除上清。

注：菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。

2．   向菌体沉淀的离心管中加入250 μl溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA）和5μl Lysis Dye，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀，此时溶液为浑浊的红色。

注：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

3．   加入250 μl溶液P2，温和地上下翻转6–8次使菌体充分裂解，此时溶液变为澄清的红色。

注：温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA；所用时间绝对不应超过5分钟 ，以免质粒受到破坏；红色溶液应该透明均一，如有浑浊红色颗粒，表明裂解不充分，会大大降低质粒提取效率。

4．   加入350 μl溶液P3，立即温和地上下翻转，充分混匀，混匀充分的标志是溶液完全呈透明的黄色，如有可见红色，说明混匀不彻底。10,000g 离心10分钟。

注：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。

5．  小心地将上清转移到吸附柱CP中（吸附柱放入收集管中），10,000g离心30–60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP重新放回收集管中。

6．向吸附柱CP中加入500 μl去蛋白液PD，10,000g离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP重新放回收集管中。

7．  向吸附柱CP中加入700 μl漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），10,000g 离心30–60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP重新放回收集管中。

8. 向吸附柱CP中加入500 μl漂洗液PW，10,000g 离心30–60秒，倒掉收集管中的废液。

9.  将吸附柱CP置于重新放回收集管中，10,000g 离心2分钟。

注：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，绝对不可省略，因为漂洗液中乙醇的残留会影响后续实验（酶切，PCR等）。

10. 将吸附柱CP置于一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜的中央部位悬空滴加50–100 μl洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，10,000g 离心2分钟将质粒溶液收集到离心管中，-20℃保存。

注：● 为了增加质粒的回收效率，可将得到的洗脱液重新加入离心吸附柱中，再次离心收集。

● 洗脱缓冲液体积不应少于50 μl，体积过小影响回收效率。

● 洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低

洗脱效率。

●不使用Lysis Dye的标准操作步骤：

如非指出，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

1．   取1–5 ml过夜培养的菌液加入离心管中，10,000 g离心1分钟，尽量吸除上清。

注：菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。

2．   向菌体沉淀的离心管中加入250 μl溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。

注：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

3．  加入250 μl溶液P2，温和地上下翻转6–8次使菌体充分裂解。

注：温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA；所用时间绝对不应超过5分钟，以免质粒受到破坏。

4．   加入350 μl溶液P3，立即温和地上下翻转6–8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。10,000g 离心10分钟。

注：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

5．  小心地将上清转移到吸附柱CP中（吸附柱放入收集管中），10,000g 离心30–60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP重新放回收集管中。

6．向吸附柱CP中加入500 μl去蛋白液PD，10,000g离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP重新放回收集管中。

7．   向吸附柱CP中加入700 μl漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），10,000g 离心30–60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP重新放回收集管中。

7      向吸附柱CP中加入500 μl漂洗液PW，10,000g 离心30–60秒，倒掉收集管中的废液。

8.  将吸附柱CP置于收集管中，10,000g 离心2分钟。

注：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，绝对不可省略，因为漂洗液中乙醇的残留会影响后续实验（酶切，PCR等）。

9．   将吸附柱CP置于一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜的中央部位悬空滴加50–100 μl洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，10,000g离心2分钟将质粒溶液收集到离心管中，-20℃保存。

注：● 为了增加质粒的回收效率，可将得到的洗脱液重新加入离心吸附柱中，再次离心收集。

● 洗脱缓冲液体积不应少于50 μl，体积过小影响回收效率。

● 洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。