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总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒

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   意:正式测定前务必取 3 - 5 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

测定对象中各种抗氧化物质和抗氧化酶等构成总抗氧化水平。在生物学、医学和药学研究中常常检测血浆、血清、唾液、尿液等各种体液,细胞或组织等裂解液、植物或中草药抽提液及各种抗氧化物(antioxidant)溶液的总抗氧化能力。

测定原理:

在酸性环境下,抗氧化物质还原 Fe3+-三吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)产生蓝色的 Fe2+-TPTZ 的能力反映了总抗氧化能力。

自备实验用品:

恒温水浴锅、低温离心机、酶标仪、96 孔板和蒸馏水。

试剂组成和配制:

提取液:液体 120mL×1 瓶,使用前预冷。

试剂一:液体 20 mL×1  瓶,避光保存。

试剂二:液体 2 mL×1 瓶,4℃避光保存。

试剂三:液体 2 mL×1 瓶,避光保存
样品的制备:

(1)血清、血浆、唾液或尿液等液体样品

血浆(制备时可以使用肝素或柠檬酸钠抗凝,不宜使用 EDTA 抗凝)4℃,5000rpm  离心10min,取上清待测。血清、唾液或尿液样品直接用于测定,也可以-80℃冻存(不宜超过30 d)后再测定。

(2)组织样品

按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL提取液)进行冰浴匀浆,然后离心 10min(10,000g离心力,4℃),取上清,置冰上待测。

(3)细胞样品

按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入1mL 提取液),冰浴超声波破碎(功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);离心 10min(10,000g离心力,4℃),取上清,置冰上待测。

操作步骤:

1、 酶标仪预热 30min,调节波长至 593nm。

2、 混合液:根据使用量,将试剂一、试剂二、试剂三按 10:1:1 的比例混合,现用现配,使用前 37℃ 预热。

3、 操作表

试剂名称μL)

测定管

空白管

(只做一管)

样品

10

 

提取液

 

10

混合液

190

190

充分混匀,反应 20min,于 96 孔板,测定 593nm 吸光值,

△A= A 测定-A 空白

 

 

注意:若测定管吸光值大于 1.5 则需要用提取液稀释(计算公式中乘以稀释倍数)。
总抗氧化能力计算公式:

标准曲线:y = 1.2416x + 0.0134R2 = 0.9996

x:Trolox 浓度(μmol/mL)   y:吸光值差值△A

单位定义:用从标准曲线上获得的抗氧化剂 Trolox 的量来表示样本的总抗氧化能力。

1)按样本质量计算

总抗氧化能力(μmol Trolox/g 鲜重)=(△A-0.0134)÷1.2416×V 样÷(V 样÷V 样总×W)

=0.8054×(△A-0.0134)÷W

2)按样本蛋白浓度计算

总抗氧化能力(μmol Trolox/mg prot)=(△A-0.0134)÷1.2416×V 样÷(V 样÷V 样总×Cpr)

=0.8054×(△A-0.0134)÷Cpr

3)按细胞计算

总抗氧化能力(μmol Trolox/104cell)=(△A-0.0134)÷1.2416×V  样÷(V 样÷V 样总×细胞数量(万个))

= 0.8054×(△A-0.0134)÷ 细胞数量(万个)

4)按液体体积计算

总抗氧化能力(μmol Trolox/mL)=(△A-0.0134)÷1.2416

=0.8054×(△A-0.0134)

V 样总:加入提取液体积,1 mL;

V 样:反应中样品体积,10μL;

W:样品质量,g;

Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL

注意事项:

1.试剂二对人体有刺激性,请采取适当的防护措施。为了您的安全和健康,请穿实验服并戴乳胶手套操作。

2.尽量避免使用在酸性条件下呈蓝色或接近蓝色的试剂,否则对本试剂盒的检测结果产生干扰。

3.样品中不宜添加Tween、Triton 和 NP-40 等去垢剂和DTT、巯基乙醇等影响氧化还原反应的还原剂。

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