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还原型谷胱甘肽(GSH)试剂盒

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    意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

GSH是细胞内最主要的抗氧化巯基物质,在抗氧化、蛋白质巯基保护和氨基酸跨膜运输等中具有重要作用。还原型与氧化型比值(GSH/GSSG)是细胞氧化还原状态的主要动态指标。因此,测定细胞内GSHGSSG含量以及GSH/GSSG比值,能够很好地反映细胞所处的氧化还原状态。

 

测定原理:

DTNBGSH反应生成复合物,在412nm处有特征吸收峰;其吸光度与GSH含量成正比。

 

自备仪器和用品

可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。

 

试剂组成和配制:

试剂一:液体×1瓶,4保存

试剂二:液体×1瓶,4保存

试剂三:液体×1瓶,4避光保存

 

粗酶液提取

1. 组织:按照组织质量(g试剂一(mL)15~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。8000g4离心10min,取上清置冰上待测。

2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~10001的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g4,离心10min,取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体:直接测定。

 

GSH测定操作:

1. 分光光度计预热30min,调节波长到412 nm,蒸馏水调零。

2. 试剂二置于25(一般物种)或者37(哺乳动物)水浴中保温30min

3. 空白管:取1mL玻璃比色皿,依次加入100μL蒸馏水,700μL试剂二,200μL试剂三,混匀静置2min后测定412 nm吸光度A1

4. 测定管:取1mL玻璃比色皿,依次加入100μL上清液,700μL试剂二,200μL试剂三,混匀静置2min后测定412 nm吸光度A2

注意:空白管只需要测定一次。

 

GSH含量计算公式

GSH标准曲线公式:y=1.5 xxGSH浓度,μ mol /mLy为吸光值)

GSH计算:

1)按蛋白浓度计算

GSHμ mol/ mg prot=(A2A1) ÷1.5×V÷V×Cpr =0.667×(A2A1) ÷Cpr

2按样本鲜重计算

GSHμ mol/g鲜重=(A2A1) ÷1.5×V÷(V÷V样总×W)=0.667×(A2A1) ÷W

3)按细胞数量计算

GSHμ mol /104 cell=(A2A1) ÷1.5×V÷(V÷V样总×细胞数量)=0.667×(A2A1) ÷细胞数量

4)按液体体积计算

GSHμ mol/ mL=(A2A1) ÷1.5×V÷V=0.667×(A2A1)

 

V样总:上清液总体积,1 mLV样:加入反应体系中上清液体积,100μL=0.1 mLW:样品质量g Cpr:上清液蛋白质浓度,mg/mL

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