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辅酶Ⅱ NADP(H)含量测试盒

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   意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

辅酶NADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,NADP+NADPH含量测定可以计算NADPNADPH + NADP+ )含量和NADPH/NADP+比值,其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP+比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一,而且在PPP途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。

 

测定原理:

分别用酸性和碱性提取液提取样品中NADP+NADPHNADPH通过PMS的递氢作用,使氧化型噻唑蓝(MTT)还原为甲瓒,570nm下检测吸光值,从而测定NADPH含量。利用6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原NADP+NADPH,从而检测NADP+含量。

 

所需的仪器和用品:

可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

 

试剂的组成和配制:

酸性提取液:50mL×1瓶,4℃保存;

碱性提取液:50mL×1瓶,4℃保存;

试剂一:液体15 mL×1瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×1支,-20 ℃保存,用时加入4mL蒸馏水,混匀;用不完的试剂4℃保存一周;

试剂三:粉剂×1支,-20℃保存,用时加入4mL蒸馏水,混匀;用不完的试剂4℃保存一周;

试剂四:粉剂×1支,4 ℃保存,用时加入4mL蒸馏水,混匀;用不完的试剂4℃保存一周;

试剂五:液体1.8mL×1支,4 ℃保存;

试剂六:液体30mL×1瓶,4 ℃保存;

试剂七:液体50mL×1瓶,4 ℃保存。

 

NADP+NADPH的提取:

1 血清(浆)中NADP+NADPH的提取

NADP+的提取:按照血清(浆)体积(mL):酸性提取液体积(mL)为15~10的比例(建议取约0.1mL血清(浆),加入1mL酸性提取液),95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取500μL上清液,加入500μL碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。

NADPH的提取:按照血清(浆)体积(mL):碱性提取液体积(mL)为15~10的比例(建议取约0.1mL血清(浆),加入1mL碱性提取液),95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取500μL上清液,加入500μL酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2组织中NADP+NADPH的提取:

 

NADP+的提取:按照组织质量(g):酸性提取液体积(mL)为15~10的比例(建议取约0.1g组织,加入1mL酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取500μL上清液,加入500μL碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。

NADPH的提取:按照组织质量(g):碱性提取液体积(mL)为15~10的比例(建议取约0.1g组织,加入1mL碱性提取液),冰浴研磨,95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取500μL上清液,加入500μL酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。

3 细胞或细菌中NADP+NADPH的提取:

NADP+的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104个):酸性提取液体积(mL)为500~10001的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL酸性提取液),超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次),95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取500μL上清液,加入500μL碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。

NADPH的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104个):碱性提取液体积(mL)为500~10001的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL碱性提取液),超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次),95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取500μL上清液,加入500μL酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。

 

测定步骤:

1、分光光度计预热30min以上,调节波长至570nm,蒸馏水调零。

2、加样表(1.5mL棕色EP管中按下表依次加样):

试剂名称(μL)对照管测定管

样本5050

试剂一250250

试剂二7575

试剂三7575

试剂四7575

试剂五3535

试剂六500混匀,室温避光静置20min

试剂六500

充分混匀,静置5min后,20000g25℃离心5min,弃上清,沉淀中加入:

试剂七10001000

混匀,570nm下比色,读取对照吸光值A1和测定管吸光值A2,计算△A=A2-A1

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