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γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶(GCL)试剂盒

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    意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

GCL  GSH 合成的限速酶,GSH  GCL 有反馈抑制作用。GCL基因表达受多种因素调节,如氧化剂、抗氧化剂、生长因子和炎症因子等。GCL活性高低对GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影响。


测定原理:

ATPMg2+存在下,GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸;同时ATP去磷酸化产生无机磷分子,通过测定无机磷增加速率,即可计算出GCL活性。

 

自备仪器和用品:

可见分光光度计、冷冻离心机、水浴锅、移液器、1mL玻璃比色皿、浓硫酸和蒸馏水。

 

试剂组成和配

试剂一:液体70mL×1瓶,4保存。

试剂二:粉剂×1瓶,4保存。临用前加14mL蒸馏水充分震荡溶解。

试剂三:粉剂×1瓶,4保存。临用前加入蒸馏水3.5 mL充分震荡溶解。

试剂四:液体16mL×1瓶,室温保存。

试剂五:粉剂×1瓶,4保存。临用前加入30mL蒸馏水,充分震荡溶解后,缓缓加入1.0 mL浓硫酸(自备),边加边搅拌。

 

粗酶液提取: 

1. 组织:按照组织质量(g试剂一(mL)15~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。8000g4离心10min,取上清,置冰上待测。

2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~10001的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g4,离心10min,取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体:直接测定。

 

GCL测定操作

1. 分光光度计预热30min,调节波长到660 nm,蒸馏水调零。

2. 空白管:1.5mLEp管,依次加入试剂一240 µL、试剂二260µL、试剂三60µL蒸馏水120µL,混匀后盖紧,37水浴准确反应15 min 加入试剂四300µL,混匀后,258000g离心10 min,取上清500µL加入试剂五500µL,混匀后盖紧,45水浴10min,冷却后测定660 nm吸光值记为A空白管

3. 测定管:1.5mLEp管,依次加入试剂一240 µL、试剂二260µL、试剂三60µL和上清液120µL,混匀后盖紧,37水浴准确反应15 min 加入试剂四300µL,混匀后,258000g离心10 min,取上清500µL加入试剂五500µL,混匀后盖紧,45水浴10min,冷却后测定660 nm吸光值记为A测定管

注意:空白管只需要测定一次。

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