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Stbl3 电击感受态细胞

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  • 介绍: 基 因 型F- mcrB mrr hsdS20(rB-, mB-) recA13 supE44 ara-14 galK2 lacY1 proA2 rpsL20(StrR) xyl-5λ-leu mtl-1 endA1+简 要 说 明Stbl3菌株来源于 HB101 E. coli strain,是慢病毒载体系统推荐使用的菌株。基因组含有重组酶recA13突变,可有效抑制长片段末端重复区的重组,降低错误重组的概率;但不含核酸酶endA1突变,体内核酸酶含量较高,提取质粒时务必使用质粒提取试剂盒中去蛋白液。此菌株具有链霉素抗性,不存在lacIqZΔM15,不可用于蓝、白斑筛选。High5TM系列Stbl3感受态细胞经特殊工艺制作,经pUC19检测转化效率>108cfu/μg DNA。
  • 操 作 说 明
  • 1.0.1cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟,待其沥干水分,正置5分钟,使乙醇充分挥发,待乙醇挥发干净立即插入冰中,压实冰面,电极杯顶离冰面0.5cm以方便盖上杯盖,冰中静置5分钟充分降温。
  • 2.取-80℃保存的Stbl3电击感受态细胞插入冰中5分钟,待其融化,加入目的DNA(质粒或连接产物)并用手拨打 EP 管底轻轻混匀,避免产生气泡,立即插入冰中。
  • A.测定转化效率使用 1 μl 10 pg/μl 的对照质粒 pUC19;
  • B.对于连接产物,请用乙醇沉淀 DNA 后加入适量 TE 缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬,DNA 浓度不超过 100 ng/μl,体积不超过 5 μl/50 μl 感受态。
  • 3.用200μl 枪头(用刀切除 0.5cm 枪尖)将感受态-DNA 混合物快速移到电击杯中,避免产生气泡,盖上杯盖。
  • 4.启动电转仪,设置参数:C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV (此为 BioRad 电转仪推荐参数,也可按所用 电转仪推荐的参数操作),将电击杯快速放入电转槽中,电击完成快速插入冰中。
  • 5.立即 向电击杯中加入1000 μl不含抗生素的无菌培养基 S.O.C.,混匀后转移到空50ml管中,并用1ml SOC轻柔冲洗电转杯并转移到50ml管中,另补加3ml SOC培养基, 37℃,200 rpm复苏60分钟。
  • 6.5000 rpm 离心一分钟收菌,重悬后取 100-200 μl 涂布到含相应抗生素的 S.O.C 平板上(因菌量较大, 若全部涂板请选用直径 15cm 培养皿 2-5 个)。将平板倒置放于 37℃培养箱过夜培养过夜。
  • 注 意 事 项
  • 1. 加入DNA 时体积不应大于感受态体积的1/10。
  • 2. 电击感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡,气泡会增加弧光放电风险。
  • 3. 当DNA 不纯或存在盐,乙醇,蛋白及缓冲液等污染时,转化效率急剧下降。
  • 4. 电击杯里的离子可增加溶液的电导,增大在含有细胞和DNA 的溶液中产生电流和弧光放电的风险。
  • 5. 若转化大质粒或想获得较高转化效率,推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。
  • 6. 对于连接产物转化,最好转化前乙醇沉淀DNA 后用适量TE 缓冲液(10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬产物,保证DNA 浓度不超过100 ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率,增加弧光放电的风险。
  • 7. 混入质粒时应轻柔操作,吸取感受态细胞时避免用力过猛,以免剪切力过大损伤细胞膜,降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。
  • 8. 电击感受态细胞最好保存在-80℃以下,高于-80℃超期储存会导致转化效率会
  • 储存条件: -80℃
  • 用途: 克隆感受态细胞
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