1、订购使用抗体产品的客户，在使用产品过程中遇到问题，提出技术支持及其他请求时，我公司接到请求后的24个小时之内做出处理。
2、我公司的所有产品都经过严格的质检后上架销售，如经复核确实存在问题，本公司无条件退款或更换货。
3、所有书面反馈我们收到后48小时内给出答复。
使用说明：
1. 样品的制备。
a. 选择合适的裂解液，用于制备细胞或组织的裂解液。优先推荐选择我司生产的P0013 Western及IP细胞裂解液用于细胞或组织样品的裂解。根据特定的实验目的，如有必要，也可以使用我司生产的P0013B RIPA裂解液(强)、P0013C RIPA 裂解液(中)或P0013D RIPA裂解液(弱)用于样品的制备。如果使用自行配制的或其它公司生产的裂解液，需要确保裂解液的pH为6-8。
b. 具体的细胞或组织样品裂解的制备步骤请参考裂解液的使用说明。制备好的裂解液上清宜置于冰上或4ºC存放，随后即可用于免疫沉淀或免疫共沉淀、标签蛋白的纯化等操作。新鲜制备好的样品，建议尽量当天完成免疫沉淀等后续操作， 但如果样品不能当天使用，也可以适当分装后-80ºC冻存。
2. Anti-Flag磁珠的准备。
由于Anti-Flag磁珠储存在特殊保护液中，所以需要在加入样品前适当洗涤。
a. 用移液器轻轻吹打重悬Anti-Flag磁珠，按照每500μl样品10μl或20μl磁珠悬浊液，取适量Anti-Flag磁珠至一洁净离心管中(FTUB015)，加入1X TBS (ST661/ST665)至最终体积为约0.5ml。说明：如果初始体积大于0.2ml，可以考虑先直接置于磁力架(FMS012/FMS024)上分离10秒，去除上清，然后再加入1X TBS (ST661/ST665)至最终体积为约0.5ml。
b. 用移液器轻轻吹打重悬Anti-Flag磁珠。置于磁力架(FMS012/FMS024)上分离10秒，去除上清。重复上述步骤两次。
c. 按照初始体积的量，用1X TBS (ST661/ST665)重悬Anti-Flag磁珠。
3. 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP):
a. 加入磁珠与孵育。按照每500μl蛋白样品加入10μl或20μl磁珠悬浊液的比例加入Anti-Flag磁珠，置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育2小时或4ºC孵育过夜。注：孵育过程中，如果磁珠发生聚团或呈片状属正常现象，不会影响实验结果。
b. 磁分离。孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，去除上清。注：可保留部分上清液，用于检测免疫沉淀的效果。
c. 洗涤。加入500μl的1X TBS，用移液器轻轻吹打重悬Anti-Flag磁珠。置于磁力架上分离10秒，去除上清。重复洗涤三次。注：也可以通过检测洗涤得到的洗涤液的OD280来判断是否洗涤完全，若OD280大于0.05，应适当增加洗涤次数。
4. 洗脱：
根据标签蛋白的特点及后续实验要求，可以选择如下3种方法之一进行洗脱。
a. 3X Flag竞争洗脱法：本方法为非变性法，洗脱效率高，且洗脱后的蛋白保持原有的生物活性，便于后续分析检测。
(a) 3X Flag多肽洗脱液的配制：取适量3X Flag多肽(P9801)溶解于1X TBS中，使其终浓度为150μg/ml，或稀释5mg/ml的3X Flag多肽溶液(P9801)至150μg/ml。
(b) 每10-20μl原始磁珠体积，加入100μl 3X Flag多肽洗脱液(150μg/ml)，混匀后置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温摇晃孵育30-60分钟，或4ºC孵育1-2小时。为了提高洗脱效率，可延长孵育时间或重复洗脱。
(c) 孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，将上清转移到新的离心管中。上清即为洗脱的Flag标签蛋白。
(d) 洗脱的Flag标签蛋白置于4ºC待用，或者-20ºC或-80ºC长期保存。
b. 酸性洗脱法：本方法为非变性法，比较快速且高效。洗脱后的蛋白保持原有的生物活性，便于后续分析检测。
(a) 溶液的配制：酸性洗脱液(0.1M Glycine-HCl, pH3.0)，中和液(0.5M Tris-HCl, pH7.4, 1.5M NaCl)。
(b) 每10-20μl原始磁珠体积，加入100μl酸性洗脱液，混匀后置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育5分钟。注：孵育时间不宜超过15分钟。
(c) 孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，将上清转移到新的离心管中，并立刻加入10μl中和液，适当混匀。
(d) 为了获得最大的洗脱效率，可重复步骤b和c，并将相同样品合并。
(e) 洗脱并中和的Flag标签蛋白置于4ºC待用，或者-20ºC或-80ºC长期保存。
注1：酸性洗脱法虽然高效，但仍可能低于竞争洗脱法或SDS-PAGE上样缓冲液洗脱法。
注2：由于目的蛋白的差异可能对酸性洗脱法的洗脱效率有一定的影响，如果对洗脱效率的要求比较高，可对酸性洗脱液的pH在2.5-3.1之间进行一定的调整，相应的中和液的pH值或量也要进行一定的调整，例如100μl酸性洗脱液(0.1M Glycine-HCl, pH2.8)和15μl中和液(1M Tris-HCl, pH8.5)。
c. SDS-PAGE上样缓冲液洗脱法：本方法为变性法，得到的蛋白样品适合SDS-PAGE电泳或WB检测。
(a) SDS-PAGE上样缓冲液的配制：可以直接使用我司生产的P0015A SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(1X)，或使用我司生产的P0015 SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)或自行参考《分子克隆》等配制5X或2X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，然后加入水配制成1X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。通常SDS-PAGE蛋白上样缓冲液含有DTT等还原剂，其洗脱得到的蛋白样品中会含有Flag抗体的轻链和重链。
(b) 每10-20μl原始磁珠体积的磁珠，加入100μl 1X SDS-PAGE上样缓冲液，95ºC加热5分钟。
(c) 置于磁力架上分离10秒，取上清进行SDS-PAGE电泳或Western检测。
保存条件：
4ºC保存，两年有效。长期不使用，可以-20ºC保存，-20ºC可以保存更长时间。
注意事项：
Ø 本产品经测试，反复冻融3次以上，不影响使用效果。
Ø 本产品需维持pH为6-8，避免高速离心、干燥或冻存；请勿长时间将磁珠置于磁场中，否则可能会引起磁珠聚团。
Ø 本产品使用前要适当充分重悬，即颠倒若干次使磁珠混合均匀，混匀操作须轻柔，不宜剧烈涡旋震荡等，避免抗体变性等。
Ø 在免疫沉淀或纯化时，建议设置阳性和阴性对照组。
Ø 蛋白样品收集后宜尽快完成纯化工作，并应始终放置在4ºC或冰浴，以减缓蛋白降解或变性。为有效抑制蛋白降解，可以在蛋白样品中添加适量的蛋白酶抑制剂混合物，例如我司的P1005/P1006蛋白酶抑制剂混合物(通用型)、P1048/P1049 蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物(通用型, 质谱兼容, 50X)、P1010/P1011 蛋白酶抑制剂混合物(哺乳动物样品抽提用, 100X)、P1050/P1051 蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物(哺乳动物样品抽提用, 50X)等。
Ø 如果使用真空泵等仪器吸取上清液，须注意真空泵的吸液强度，以免吸力过大而吸取到聚集的磁珠。
Ø 酸性溶液洗脱时磁珠可能会发生聚集，属于正常现象，不影响磁珠的正常使用。0.1%的非离子型去垢剂(如Triton X-100、Tween-20或NP-40)可有效防止磁珠聚集，并且不会影响磁珠的抗体结合效率。
Ø 高浓度的DTT、巯基乙醇、盐酸胍等对本产品与标签蛋白的结合可能有一定影响，但Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA 裂解液(P0013B/C/D)或NP-40裂解液(P0013F)等都完全适用。
Ø 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
Ø 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
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