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组织微环境中有复杂的细胞组成，这些细胞的表型、状态、丰度、分布都有着重要的生物学意义和临床价值。借助抗体染色可以将其在组织原位上呈现出来。免疫组化染色是一种研究组织形态和原位蛋白表达的常见技术，常规IHC检测只能展示单一指标，难以呈现复杂的组织微环境中的细胞组成、状态和关系，而这些信息对疾病的诊断和治疗至关重要！
酪氨信号放大技术原理：类似常规免疫组化的DAB显色方法，TSA技术同样采用HRP标记的二抗，HRP催化加入体系的荧光素底物，生产活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸共价结合，使样品上稳定的共价结合荧光素。之后用热修复法洗去非共价结合的抗体，在换下一种一抗来第二轮孵育，换另一种荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。
产品组分：*表示可选组分，下单前需要确认备注到订单
产品组分：*表示可选组分，下单前需要确认备注到订单
| 名 称 | 规格(100T) | 保存温度 | 激发波长（nm） | 发射波长（nm） |
| SuperNova488（200x）*A | 50ul | -20℃ | 490 | 515 |
| SuperNova532（200x）*B | 50ul | 527 | 558 | |
| SuperNova555（200x）*C | 50ul | 555 | 565 | |
| SuperNova594（200x）*D | 50ul | 593 | 614 | |
| SuperNova620（200x）*E | 50ul | 617 | 639 | |
| SuperNova640（200x）*F | 50ul | 642 | 662 | |
| SuperNova680（200x）*G | 50ul | 681 | 698 | |
| DAPI（100*母液） | 100ul | 2-8℃ | 360 | 461 |
| 信号放大液 | NA | |||
| 羊抗小鼠二抗(三选一） *H | NA | |||
| 羊抗兔二抗（三选一） *I | NA | |||
| 鼠兔通用二抗（三选一）*J | NA | |||
| 抗荧光淬灭封片剂 | 5mlx2 |
应用
主要用于人源或小鼠组织、石蜡切片、TMA芯片的免疫组化染色。
使用方法
样本要求：
1. 福尔马林固定的蜡块或玻片，大块组织或TMA，封蜡不能有明显的破损。
2. 玻片样本，组织需要紧贴玻片，避免褶皱，玻片不能有破损、划伤或污渍。
3. 组织最小应包含大于1000 个细胞。
4. 蜡块需包埋实体瘤组织，坏死瘤组织、细针穿刺物、细胞甩片样品会影响染色效果。
5. 组织应当用10%中性福尔马林固定，正常固定时间为18～24 小时。
6. 切片厚度为4um 左右，使用防脱玻片。建议玻片在固定后一周内制备为佳。
7. 不要在水浴捞片环节添加任何粘合剂，样本应置于玻片正面、中央。将捞片竖直置于吸水纸上去除水分，轻敲去除水滴。
8. 切片后玻片置于40℃干燥箱上放置30min，确保水分去除、贴片牢固。
试剂准备：
1) TBST 洗液：25 mM TRIS-HCl （pH 7.5），150 mM NaCl，0.05% Tween®20 (v/v)
2) 抗原修复液：根据一抗选择柠檬酸钠或者EDTA修复液
3) 抗体稀释液：可做抗体稀释和封闭使用，即用型
4) 一抗工作液：现用现配，根据预实验条件优化浓度
5) 二抗工作液：二抗工作液为HRP-羊抗鼠兔或兔双抗
6) 荧光染料染色工作液：系列单色荧光染料为200X 母液，使用前用TSA 信号放大反应液1:
200 稀释用配好的工作液4℃保存，仅限当天使用。
7) DAPI 工作液：DAPI 使用无菌水按1：100稀释制备工作液
操作步骤：建议采用实验操作表格进行记录
1. 样品脱蜡准备：
a) 温箱设置到55℃-60℃，烤片1h 以上。
b) 新鲜二甲苯浸片10min，重复3 次。
c) 梯度乙醇浸片：100% 3min；95% 3min；70% 3min。
d) 灭菌水洗片1min，重复3 次。
2. 多重荧光免疫组化染色步骤(A、B、C 三种抗体为例) ：
A 抗体
A.1 抗原修复：把1X 抗原修复液倒入修复杯中微波炉高火加热3min 煮沸，立刻放入切片，低火（约20%功率） 继续加热15min 后冷却至室温。进行该步骤之前建议不放样品进行一次预实验，检测15min 后液面是否高于样品，避免干片，抗原修复液不能2 次使用。
A.2 封闭：去除玻片上残存洗液，用组化笔圈出玻片上的样本区域，滴加抗体稀释液/封闭液，覆盖样本区域， 室温孵育10min。
A.3 一抗孵育：用抗体稀释液按照推荐比例稀释A 抗体，去除玻片上的封闭液，加一抗至完全覆盖样本，室温孵育30min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分钟。
A.4 二抗孵育：去除玻片上残存的洗液，滴加羊抗鼠兔HRP 标记二抗抗体，浸没样本区域，室温孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分钟。
A.5 荧光染色放大信号：去除玻片上残存的洗液，滴加荧光染料染色工作液，室温孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分钟。
A.6 微波修复：把1X 抗原修复液倒入修复杯中微波炉高火加热3min，立刻放入切片，低火（约20%功率）继续加热10min 后冷却至室温。
B 抗体
B.1 封闭：去除玻片上残存洗液，用组化笔圈出玻片上的样本区域，滴加抗体稀释液/封闭液，覆盖样本区域， 室温孵育10min。
B.2 一抗孵育：用抗体稀释液按照推荐比例稀释B 抗体，去除玻片上的封闭液，加一抗至完全覆盖样本，室温孵育30min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分钟。
B.3 二抗孵育：去除玻片上残存的洗液，滴加羊抗鼠兔HRP 标记二抗抗体，浸没样本区域，室温孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分钟。
B.4 荧光染色放大信号：去除玻片上残存的洗液，滴加荧光染料染色工作液，室温孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分钟。
B.5 微波修复：把1X 抗原修复液倒入修复杯中微波炉高火加热3min，立刻放入切片，低火（约20%功率） 继续加热10min 后冷却至室温。
C 抗体
C.1 封闭：去除玻片上残存洗液，用组化笔圈出玻片上的样本区域，滴加抗体稀释液/封闭液，覆盖样本区域， 室温孵育10min。
C.2 一抗孵育：用抗体稀释液按照推荐比例稀释C 抗体，去除玻片上的封闭液，加一抗至完全覆盖样本，室温孵育30min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分钟。
C.3 二抗孵育：去除玻片上残存的洗液，滴加羊抗鼠兔HRP 标记二抗抗体，浸没样本区域，室温孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分钟。
C.4 荧光染色放大信号：去除玻片上残存的洗液，滴加荧光染料染色工作液，室温孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分钟。
C.5 微波修复：把1X 碱性抗原修复液倒入修复杯中微波炉高火加热3min，立刻放入切片，低火（约20%功率） 继续加热10min 后冷却至室温。
每轮染色结束后可用荧光显微镜确认染色情况，注意用TBST 覆盖样品，防止干片。
3. DAPI 复染及封片：
去除玻片上残存洗液，滴加DAPI 工作液，室温孵育5min，用1X TBST 浸洗玻片2 分钟，用灭菌水洗片2 分钟， 在样品上滴加适量抗淬灭封片剂，加盖玻片，小心排除气泡，用透明指甲油封住盖玻片四周，室温晾干，4℃ 避光保存。
4. 成像：
选用成像设备按照染料光谱条件设置拍摄条件，对染色后的组织片在荧光显微镜下数据并进行
判读分析。
1. 福尔马林固定的蜡块或玻片，大块组织或TMA，封蜡不能有明显的破损。
2. 玻片样本，组织需要紧贴玻片，避免褶皱，玻片不能有破损、划伤或污渍。
3. 组织最小应包含大于1000 个细胞。
4. 蜡块需包埋实体瘤组织，坏死瘤组织、细针穿刺物、细胞甩片样品会影响染色效果。
5. 组织应当用10%中性福尔马林固定，正常固定时间为18～24 小时。
6. 切片厚度为4um 左右，使用防脱玻片。建议玻片在固定后一周内制备为佳。
7. 不要在水浴捞片环节添加任何粘合剂，样本应置于玻片正面、中央。将捞片竖直置于吸水纸上去除水分，轻敲去除水滴。
8. 切片后玻片置于40℃干燥箱上放置30min，确保水分去除、贴片牢固。
试剂准备：
1) TBST 洗液：25 mM TRIS-HCl （pH 7.5），150 mM NaCl，0.05% Tween®20 (v/v)
2) 抗原修复液：根据一抗选择柠檬酸钠或者EDTA修复液
3) 抗体稀释液：可做抗体稀释和封闭使用，即用型
4) 一抗工作液：现用现配，根据预实验条件优化浓度
5) 二抗工作液：二抗工作液为HRP-羊抗鼠兔或兔双抗
6) 荧光染料染色工作液：系列单色荧光染料为200X 母液，使用前用TSA 信号放大反应液1:
200 稀释用配好的工作液4℃保存，仅限当天使用。
7) DAPI 工作液：DAPI 使用无菌水按1：100稀释制备工作液
操作步骤：建议采用实验操作表格进行记录
1. 样品脱蜡准备：
a) 温箱设置到55℃-60℃，烤片1h 以上。
b) 新鲜二甲苯浸片10min，重复3 次。
c) 梯度乙醇浸片：100% 3min；95% 3min；70% 3min。
d) 灭菌水洗片1min，重复3 次。
2. 多重荧光免疫组化染色步骤(A、B、C 三种抗体为例) ：
A 抗体
A.1 抗原修复：把1X 抗原修复液倒入修复杯中微波炉高火加热3min 煮沸，立刻放入切片，低火（约20%功率） 继续加热15min 后冷却至室温。进行该步骤之前建议不放样品进行一次预实验，检测15min 后液面是否高于样品，避免干片，抗原修复液不能2 次使用。
A.2 封闭：去除玻片上残存洗液，用组化笔圈出玻片上的样本区域，滴加抗体稀释液/封闭液，覆盖样本区域， 室温孵育10min。
A.3 一抗孵育：用抗体稀释液按照推荐比例稀释A 抗体，去除玻片上的封闭液，加一抗至完全覆盖样本，室温孵育30min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分钟。
A.4 二抗孵育：去除玻片上残存的洗液，滴加羊抗鼠兔HRP 标记二抗抗体，浸没样本区域，室温孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分钟。
A.5 荧光染色放大信号：去除玻片上残存的洗液，滴加荧光染料染色工作液，室温孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分钟。
A.6 微波修复：把1X 抗原修复液倒入修复杯中微波炉高火加热3min，立刻放入切片，低火（约20%功率）继续加热10min 后冷却至室温。
B 抗体
B.1 封闭：去除玻片上残存洗液，用组化笔圈出玻片上的样本区域，滴加抗体稀释液/封闭液，覆盖样本区域， 室温孵育10min。
B.2 一抗孵育：用抗体稀释液按照推荐比例稀释B 抗体，去除玻片上的封闭液，加一抗至完全覆盖样本，室温孵育30min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分钟。
B.3 二抗孵育：去除玻片上残存的洗液，滴加羊抗鼠兔HRP 标记二抗抗体，浸没样本区域，室温孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分钟。
B.4 荧光染色放大信号：去除玻片上残存的洗液，滴加荧光染料染色工作液，室温孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分钟。
B.5 微波修复：把1X 抗原修复液倒入修复杯中微波炉高火加热3min，立刻放入切片，低火（约20%功率） 继续加热10min 后冷却至室温。
C 抗体
C.1 封闭：去除玻片上残存洗液，用组化笔圈出玻片上的样本区域，滴加抗体稀释液/封闭液，覆盖样本区域， 室温孵育10min。
C.2 一抗孵育：用抗体稀释液按照推荐比例稀释C 抗体，去除玻片上的封闭液，加一抗至完全覆盖样本，室温孵育30min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分钟。
C.3 二抗孵育：去除玻片上残存的洗液，滴加羊抗鼠兔HRP 标记二抗抗体，浸没样本区域，室温孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分钟。
C.4 荧光染色放大信号：去除玻片上残存的洗液，滴加荧光染料染色工作液，室温孵育10min，用1X TBST 浸洗玻片3 次，每次2 分钟。
C.5 微波修复：把1X 碱性抗原修复液倒入修复杯中微波炉高火加热3min，立刻放入切片，低火（约20%功率） 继续加热10min 后冷却至室温。
每轮染色结束后可用荧光显微镜确认染色情况，注意用TBST 覆盖样品，防止干片。
3. DAPI 复染及封片：
去除玻片上残存洗液，滴加DAPI 工作液，室温孵育5min，用1X TBST 浸洗玻片2 分钟，用灭菌水洗片2 分钟， 在样品上滴加适量抗淬灭封片剂，加盖玻片，小心排除气泡，用透明指甲油封住盖玻片四周，室温晾干，4℃ 避光保存。
4. 成像：
选用成像设备按照染料光谱条件设置拍摄条件，对染色后的组织片在荧光显微镜下数据并进行
判读分析。
是否允许进口
允许
是否危险品
非危险品
性能
供应商
Absin
存放说明
荧光染料需避光保存，按说明书要求，收到货起有效期为12个月。
参考文献
1.Dabbs David J. 诊断免疫组织化学(M). 北京：北京大学医学出版社，2008.9. 2.【美】Ed Harlow, David Lane. 抗体技术指南(M). 北京：科学出版社，2002:79-80,105. 3.Stack, E. C., et al., Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods, 2014 70 (1): 46-58. 4.钱帮国. 焦磊. 多标记免疫荧光染色及多普成像技术在组织学研究中的应用. 中国组织化学与细胞化学杂志, 2017 (4): 373-382.
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