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植物过氧化物酶(POD)检测试剂盒(愈创木酚微板法)

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 产品简介:

过氧化物酶(peroxisome ,POD)是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶,主要存在于细胞的过氧化物酶体中,以铁卟啉为辅基,可催化过氧化氢,氧化酚类和胺类化合物,具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用,该酶属于细胞木质素合成途径中间的关键酶,研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理,为减少水果石细胞含量提高其品质提供依据。
植物过氧化物酶(POD)检测试剂盒(愈创木酚微板法)检测原理是以愈创木酚(又称 2-甲氧基酚)作为底物,在酶促反应的最适条件下采用每隔一定时间测定产物生成量的方法,于酶标仪470nm处测定吸光度,以吸光度变化所需酶量进行计算,该试剂盒主要用于植物组织的裂解液或匀浆液、血清等样品中内源性的过氧化物酶活性,尤其适用于测定水果中过氧化物酶活性。该试剂盒仅用于科研领域,不宜用于临床诊断或其他用途。

名称

100T

Storage

试剂(A): POD Lysis buffer

2×250 ml

4℃

试剂(B): POD Assay buffer

10 ml

4℃  避光

试剂(C): POD氧化剂

1 ml

4℃

试剂(D): POD终止液

1 ml

RT  避光

使用说明书

1

自备材料:
1、蒸馏水
2、研钵或匀浆器
3、离心管
4、低温离心机
5、水浴锅或恒温箱
6、96孔板、酶标仪
操作步骤(仅供参考):
1、准备样品:
①植物样品:取 2g 植物组织或水果中层果肉加入 4 ml 预冷的 POD Lysis buffer 研磨或匀浆,4℃  10000g 离心 15 ~20 min,留取上清液,即为 POD粗提液,-20℃冻存,用于过氧化物酶的测定。
②血浆、血清和尿液样品:血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定,-20℃冻存,用于过氧化物酶的测定。
③细胞或组织样品:取恰当细胞或组织裂解液,如有必要用 POD Lysis buffer 进行适当匀浆,4℃ 10000g 离心 15 ~20 min,留取上清液,即为 POD粗提液,-20℃冻存,用于过氧化物酶的测定。
④高活性样品:如果样品中含有较高活性的过氧化物酶,可以使用 POD Lysis buffer 进行恰当的稀释。
2、配制 POD Assay buffer 工作液:取适量的 POD氧化剂和 POD Assay buffer,按 POD氧化剂:POD Assay buffer=1:14 混合,即为 POD Assay buffer 工作液,即配即用,不宜久置。
3、POD加样:取 96 孔板,按照下表设置对照孔孔、测定孔,注意:对照孔、测定孔中为同一待测样品,但对照孔中是提前加热煮沸 5 min 的样品。溶液应按照顺序依次加入,并注意避免产生气泡,如果样品中的 POD活性过高,可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定,样品的检测最好能设置 2 平行孔,求平均值。

加入物(μl)

对照孔

测定孔

待测样品

5(提前煮沸

5

POD Lysis buffer

145

145

POD Assay buffer 工作液

100

100

4、POD测定:立即以酶标仪,以对照孔为对照,测定 470nm 处测定孔的吸光度(A测定0)。37℃准确孵育 3 min 后,立即加入 5μl POD终止液终止反应(备选方案),以对照孔为对照,以酶标仪测定 470n m 处测定孔的吸光度(A测定1)。注意:加入 POD终止液终止反应不是必须步骤,可37℃准确孵育3 min 后,以对照孔为对照,直接以酶标仪测定470nm 处测定孔的吸光度(A测定1)。
计算:
POD活性单位的定义:在该实验条件下,每1min 吸光度变化0.01所需酶量为一个活性单位。
组织样本 POD( U) ={(A 测定 1- A 测定 0)×VT}/( W ×V S×0.01×t)
式中:A测定 1 =孵育 3 min后测定孔的吸光度值
A测定 0 =加入 POD Assay buffer 工作液后测定孔的吸光度值
W= 组织样本的重量(g)
VT =提取酶液的总体积( ml)
VS =测定时所用酶液体积(ml)
t=反应时间
液体样本 POD( U) =( A测定 1-A测定 0)/(0.01×t)
式中:A测定1=孵育3min后测定孔的吸光度值
A测定0 =加入POD Assay buffer工作液后立即测定的测定孔吸光度值t=反应时间
注意事项:
1、 待测样品中不能含有酶抑制剂,同时需避免反复冻融。
2、 POD酶液提取时,注意低温操作,防止酶活性。
3、 以煮沸的酶液为对照时,酶要充分失活。
4、 POD氧化剂和 POD终止液具有一定腐蚀性,请小心操作。
5、 POD氧化剂易挥发,请密闭保存,否则检测效率下降。
6、 如果没有酶标仪,也可以使用普通的分光光度计测定,每次检测指标不宜过多,否则操作时间不一,有可能导致样本间的差异。
7、 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期:6 个月有效。常温运输,4℃保存。

 

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