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非洲猪瘟病毒可视化 LAMP 试剂盒

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 非洲猪瘟(African Swine FeverASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine Fever VirusASFV) 引起猪的一种急性、热性、高度接触传染性疾病,病死率几乎高达 100%,ASF 最近在我国爆发,给我国养猪业造成重大损失,因此ASFV 的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用,为此本公司开发了简单快捷的 ASFV 可视化 LAMP 检测试剂盒,它具有下列特点:

1. 即开即用,用户只需要提供样品DNA

2.  LAMP 恒温扩增法扩增 ASFV 特异片段,不需要荧光 PCR 等贵重仪器。同时扩增时间只需要 1 小时,尤其适合现场或实验条件简陋的单位使用。

3. 检测灵敏性比PCR  10 倍以上。

4. 特异性高,由于使用四条针对 ASFV 保守基因的特异引物,比使用 2 条引物的PCR 专一性更高。

5. 每个反应的线性范围:10E2-10E7拷贝/μL ,

6. 最低灵敏度:10 拷贝/μL 

7. 提供无传染性的阳性对照,便于分析实验结果。

本试剂盒足够做 50  20μL 体系的 LAMP 扩增。本产品只能用于科研。

 

编号

十孔盒包装

2×可视化UNG-LAMP MagicMix

180703a

500μL(绿盖)

非洲猪瘟病毒 LAMP 引物混合液

16-23000yw

200μL(白盖)

非洲猪瘟病毒 LAMP 阳性对照

1×10E8 拷贝/μL

60908-23000pc

50μL黄盖

使用手册

16-23000sc

1 份

 

低温运输,-20℃保存,保存期限为一年。非洲猪瘟病毒阳性对照 2.0 最好单

独放置,不要污染其他试剂。

 

待测样品

一、样品 DNA 的制备

 

1. 用自选方法纯化病毒样品DNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼容,包括本公司的一管式病毒 DNAout 或其升级版柱式病毒DNAout

2. 如果有 N 个样品,则需要做 N+2 个样品制备,包括一个样品制备阳性对PC和一个样品制备阴性对照NC。样品使用量根据所选择的试剂盒决定。如果样品使用量为 XmL,则在 XmL 水中加 10μL MRSA LAMP阳性对照10000倍稀释液作为样品制备阳性对照样品制备阴性对照是直接用 X mL 水作为 阴性对照,然后和 N 个样品一起进行细菌 DNA 提取操作。得到N+2个DNA样品。

二、LAMP20μL 体系

 


反应设置:如果有 N+2  DNA 纯化样品,则最好设置 N+4  LAMP 增,增加一个 LAMP 阴性对照和 LAMP 阳性对照。在 N+2 PCR 管中加入下列成分:

成分

N+2 个

样品管

阴性对

照管

阳性对

照管

2× 可视化 UNG-LAMP

MagicMix

10 μL

10 μL

10 μL

非洲猪瘟病毒LAMP 引物

混合液

 4μL

4 μL

4 μL

N+2 样品 DNA 模板

 6 μL

-

-

LAMP 阴性对照

-

6 μL

-

LAMP 阳性对照用非洲猪瘟病毒LAMP 阳性对照100 倍稀释液

-

-

6 μL

 

 2. 混匀,此时反应液呈现非常浅的蓝色,由于是否有反应是跟阴性对照和反应前对比,所以一定要设置阴性对照,并且反应前要手机照相留存以供反应后比对。

3. 置于25℃5分钟UNG灭活可能的LAMP的污染,然后放63℃扩增60-120分钟如果不使用Loop引物,则最好保温2小时。如果是在PCR 仪中保温,必须加热盖。如果用金属浴保温,没有热盖,必须在孔中加水以填充孔和管子间的空隙,并且在管中加50uL石蜡油,否则保温期间反应体系的水分会蒸发,影响反应效率

4. 80℃10分钟灭活Bst DNA聚合酶和UNG酶。

5. 将反应管放置在白色背景(如白纸)前观察,观察反应液颜色并用手机照相留底。

实验结果分析。阳性对照将呈现蓝色,无模板的阴性对照将呈现无色或非常浅的蓝色,样品管的颜色如果接近阳性对照则说明有扩增,如果接近阴

 

性对照则说明无扩增。标准的反应结果如下图9 号为阴性,10 号为阳性,此处的 9 号和 10 号跟下步的电泳照片中的 9 号和 10 号是相同的两个样品):

9. 如果需要也可以电泳确认实验结果:取 10μL LAMP 扩增产物直接进行 2%琼脂糖凝胶电泳(本产品不需要单独加 loading buffer,最好使用 100 bp DNA Marker。如果样品为阳性,将会得到长度为 200bp 的梯形扩增产物。典型的电泳结果见下表(奇数样为阴性结果,偶数样为阳性结果。此处的 9 号和 10 号跟上步照片中的 9 号和 10 号是相同的两个样品

 

10. 注意消除环境污染,LAMP 产物易产生气溶胶,飘在空气中影响下一次实验,建议反应结束后,用紫外灭菌。先加好除阳性对照和样品以外的其它溶液,到另一个房间添加阳性对照及样品,可有效防止引物、MagicMix

 

被污染。

 

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