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鸭肝炎病毒通用探针法荧光定量PCR试剂盒

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 鸭肝炎病毒通用探针法荧光定量PCR试剂盒具有下列特点:

1.即开即用,用户只需要提供 DNA 模板。

2.引物根据 EB 病毒专一区设计,特异性高。

3.荧光定量PCR 检测,比常规 PCR 更加灵敏。

4.一管式闭管操作,降低了交叉污染。

5.本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR

本产品只适用于科研,不能用于临床诊断

 

成分

十孔盒包装

qPCR Magic Mix

500 μL棕色管

荧光PCR 专用模板稀释液

1 mL(黄盖

病毒染料法 qPCR 引物混合液

100 μL(白盖)

病毒染料法 qPCR 阳性对照

(1×10E8 拷贝/μL)

50 μL黄盖

使用手册

1 份

运输及保存:低温运输、-20℃保存,有效期一年。

自备试剂:DNA 模板、超纯水、10×ROX(根据机型决定,具体见使用方法)。

使用方法 一、稀释 PCR 阳性对照(以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 个 10 倍稀释度为例)

1. 注意:由于阳性对照浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供可以直接使用的 DNA 片段作为阳性对照。

2. 标记 个离心管,分别为 765432

3.用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液(最好用带芯枪头,下同)。

4.在 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照,充分震荡 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

5.换枪头,在 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)

充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

6.换枪头,在 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 号管中,充分震荡 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

7.重复上面的操作直到得到 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。二、样品 DNA 的制备

8.如果有 个样品,必须设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性对照),

一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL PCR 阳性对照的 10000 倍稀释的(稀释后浓度为 1×10E4 拷贝/μL10μL 相当于 万拷贝,可以将 10μL 原液加入到 990μL 自备 TE 溶液中,充分混匀,此为 100 倍稀释液。再取 10μL 此稀释液加入到 990μL 自备 TE 溶液中,充分混匀,此为 10000 倍稀释液)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样,样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品 DNA

9.用自选方法纯化 N+2 个样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。

三、设置 qPCR 反应(20 μL 体系,在样品制备室进行)

10.如果做定量分析并且只做 次重复,则标记 N+9 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,个用于 PCR 阴性对照,个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 次重复,则标记 N+4 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的N+2 个样品,个用于PCR 阴性对照(用水做模板),个用于PCR 阳性对照(用第 号阳性对照稀释液,浓度为 14810 拷贝/μL)。下面只描述定量分析的步骤, 定性分析只是把 个标曲反应缩减成 个,其余不变。

11.在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕

后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)

成分

样品管

N+2 个

PCR 阴性

对照管

PCR 阳性

对照管(2-7 管)

2×qPCR MagicMix

10 μL

10 μL

各 10 μL

染料法qPCR 引物混

合液

2 μL

2 μL

 2 μL

自备 10×ROX (见注)

2 μL

2 μL

 2 μL

N+2 待测样品 cDNA 模板

6 μL

-

-

自备超纯水

-

6

-

第 7 步所得 PCR 阳性对照稀释液(2-7 号

 

-

 

-

 6μL2 号样到

2 号管,3 号样到 3

号管…)

:仅 ABI75007700 和 7900 仪器需要使用ROX 作为对照,其他荧光 PCR 仪器(如 iCycler IQMJ OptionMJ Chromo4MX3000MX4000RotorGene 3000RotorGene 6000 和 LightCycler480)不需要使用 ROX,则用水替代。

12. 盖上盖子后上机,按下面参数进行 PCR(具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行优化)。

四、数据处理

13.如果把鸭肝炎病毒通用探针法荧光定量PCR试剂盒轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 cDNA 浓度的log 值,再推算出其浓度。

14.如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大于或等于 36。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该小于或等于30。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 34 则为阴性,如果小于或等于 30 则为阳性。如果在 30-34 之间,则重复一次。若重复结果 Ct 值小于 34,扩增曲线有明显起峰,该样本判断为阳性,否则为阴性轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 cDNA 浓度的log 值,再推算出其浓度。

 

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