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环氧琼脂糖凝胶6B

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环氧活化高流速 6B 琼脂糖微球是将环氧基团键合在琼脂糖微球 6FF 上冻干形成的一种活性中间体,可直接偶联配基制备分离介质,用于生物大分子的纯化分离。

1. 外观

本品为白色球状凝胶,无嗅、无味、无肉眼可见杂质。

2. 理化指标

环氧基

高流速 6%琼脂糖微球

颗粒形状及大小

球形50~160 μm

配基密度

20~40μmol 环氧基/ml 介质

最高流速(25℃

300 cm/h*

耐压

0.2 MPa

pH 适用范围**

2~14

 

    化学稳定性**

以下溶液中稳定:0.1mol/L NaOH;6mol/L 盐酸胍;8mol/L 尿素;4 mol/L 氯化钠一般有机溶剂;非离子型表面活性剂

*检测条件: 层析柱 16mm×300mm*柱床高 15cm,25, 流动相为 0.1mol/LNaCl

**是指偶联配基后的分离介质的性能3.运输

运输中应避免日晒、雨淋、重压,严禁与有毒、有害物品混运。

4. 贮存:冷冻干燥的产品应密封贮存在 8℃以下,对于溶胀的偶联后的介质应保存于 4℃~8℃通风、干燥、清洁的地方。避免与氧化剂接触。用过的柱子贮存在 4℃(20% 乙醇)。

5. 保质期:暂定 2 年。

6. 应用

环氧活化琼脂糖微球FF 是将环氧基团键合在琼脂糖微球 6FF 上冻干形成的一种活性中间体,可直接偶联含氨基、巯基和羟基的配基制备分离介质,用于生物大分子的纯化分离。

下面简要介绍环氧活化琼脂糖微球偶联含氨基配基的使用过程。

6.1 干粉的溶胀

   称取一定量的环氧活化高流速琼脂糖微球冻干粉,在蒸馏水中悬浮溶胀(1g 干粉约溶胀为 34ml 凝胶),放置大约 1 小时后抽滤,并用约 200mlPH 7去离子水洗涤干净其中的添加剂,并在漏斗中抽干。

6.2 配基的偶联

一般配基偶联的过程如下:

(1) 偶联溶剂:可用去离子水、碳酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。不能用含氨基和其他含亲核试剂的溶液。有时需要有机溶剂溶解配基,如用 50%二甲基甲酰胺和二氧六环等。

(2) 取一定量的配基溶解到偶联用的缓冲溶液中,使其完全溶解,最低浓度为 200μmol配基/ml 凝胶。凝胶与缓冲溶液以 10.5 11 的比例混合悬浮反应。

(3) 将溶胀的凝胶悬浮到含有配基的缓冲溶液中,在 20℃~45℃的水浴中摇荡 16 小时。也可以用其他搅拌方法使配基偶联,请勿用磁力搅拌。

(4) 反应完全后,再洗涤掉缓冲液中的多余的配基。

(5) 残余活性基团的消除,将反应完洗涤过的凝胶悬浮到 1mol/L 乙醇胺(PH 8)的溶液中,在 40℃~50℃最少反应 4 小时或者室温反应过夜。

(6) 在反应完后,用含有 0.5mol/LNaCl  0.1mol/L 醋酸缓冲液PH 4.0和含有0.5mol/LNaCl 的偶联缓冲液(PH 8.3交替洗涤,至少重复以上循环洗涤 3 次。

6.3 装柱

 

⑴让所有的材料和试剂达到室温。配制初始缓冲液(平衡液)和洗脱缓冲液。

 

⑵根据柱子大小取所需量的凝胶,清洗掉溶液,抽干,用初始缓冲液(按凝胶:缓冲液=31 的比例)配成匀浆。匀浆作脱气处理。

⑶将柱内及柱子底端用水或缓冲液润湿并保持一小段液位(液面略高于滤膜),务必使  底端无气泡。

⑷用玻璃棒引导匀浆沿着柱内壁一次性倒入柱内,注意勿使产生气泡。打开柱子出液口,使凝胶在柱内自由沉降,连结好柱子顶端柱头。

⑸打开蠕动泵,让缓冲液用使用时流速的 1.33 倍的流速流过,使柱床稳定。用 2~3 倍柱体积的缓冲液平衡柱子。

6.4 平衡

让平衡缓冲液以一定流速流过柱子,到流出液电导和 pH 不变。平衡缓冲液一般是根据需要纯化的蛋白来决定用哪种缓冲液。

6.5 上样

⑴样品用平衡液配制,浑浊的样品要离心和过滤后上样。

⑵一般情况是让目标产品结合在柱子上,用平衡液洗去杂质,再选择一种洗脱液洗下目标产品。

⑶介质对样品组分吸附的程度取决于介质配基的亲和作用、样品的亲和性质、流动相的  组成和温度。

(4)再用缓冲液平衡到流出液电导和 pH 不变。

6.6 洗脱

洗脱液也要根据需要纯化的蛋白决定。

6.7 再生

对于使用之后的凝胶,以 2~3 倍柱体积的 0.1mol/L Tris·HCl+0.5mol/L NaCl   PH=8.5 0.1mol/L NaAc+0.5mol/L NaClPH=4.5)依次反复冲洗 3~4 次,进行再生。

6.8 在位清洗

根据偶联的配基选择在位清洗的方法,以洗去柱子污染物同时不伤害柱子为原则。对于一般的污染,用 0.1mol/L NaOH 进行较长时间的清洗,对配基基本没有的影响;当严重污染后,可用 0.5mol/L NaOH 进行短时间的清洗;对于介质中含有其他试剂的,可用含有 8 mol/L 尿素和 6 mol/L 的盐酸胍的溶液进行在位清洗。若有失活蛋白或脂类物质洗不干净,可用非离子表面活性剂如 0.1% Triton 洗涤。清洗完毕后,用至少 3 倍缓冲液平衡柱子。

6.9 注意在装柱、使用和保存柱子的时候,要避免柱子流干,气泡进入。

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