总超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（NBT核黄素微板法）

一、产品简介：

超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase, SOD)是含金属辅基的酶，能催化超氧化物阴离子发生岐化作用，生成过氧化氢(H2O2)和氧气(O2)，是生物体内一种重要的抗氧化酶；由于超氧自由基是不稳定的的自由基，寿命极短，SOD活性一般用间接方法测定，并利用各种呈色反应来测定SOD活力，其中显色剂有NBT(四氮唑蓝)、WST-1、WST-8等。

雅吉生物总超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(NBT核黄素微板法)(Total Superoxide Dismutase Assay Kit with NBT)是一种基于NBT的显色反应，通过比色来检测组织、细胞、植物、血清或其它样品中SOD即超氧化物歧化酶活性的试剂盒，其检测原理是利用SOD抑制NBT在光照下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化合物存在的情况下，核黄素被光还原，后经一系列的反应可将NBT还原为蓝色的甲臜(formazan)，后者在560nm处有强吸收，SOD可清除超氧阴离子(O2.-)，从而抑制了甲臜的形成，反应液蓝色愈深说明超氧化物岐化酶活性愈低，反之则酶活性愈高，据此通过比色分析就可以计算出超氧化物岐化酶活性水平。

该试剂盒仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。

三、自备材料：

生理盐水或PBS

离心机、离心管、小试管

分光光度计、比色杯

水浴锅或恒温箱

四、操作步骤(仅供参考)：

1、 准备样品：

①血浆或含红细胞的样品：从待测样品中分理出的血清或血浆不应有溶血，如果含有应去除红细胞后检测，如超过检测范围，用SOD提取液稀释后检测。血清去除红细胞的简易方法如下：用抗凝管收集血液，颠倒混匀，取至少500μl全血，4℃ 3000g离心5min，转移上清至另一新的1ml离心管中，适量生理盐水稀释后待测；亦可采用红细胞裂解液去除红细胞，如Leagene ACK红细胞裂解液等。

②组织样品：动物用含有20U/ml Heparin的生理盐水(0.9% NaCl containing 20U/ml Heparin)灌流清除血液后获取组织样品。按照每100mg组织加入500μl SOD提取液的比例，用玻璃匀浆器在4℃或冰浴匀浆，4℃ 4000g离心10min，取上清液(SOD粗提液)用于酶活性的测定。

③细胞样品：对于贴壁细胞，由于后续用于酶活性的测定，避免使用胰酶消化细胞。可以使用细胞刮或EDTA处理细胞并收集细胞，细胞用无菌的PBS或生理盐水洗涤1次，按照每10⁶细胞加入300～500μl SOD提取液的比例，用玻璃匀浆器在4℃或冰浴匀浆，4℃ 10000g离心10min，取上清液(SOD粗提液)用于酶活性的测定。

④植物样品：准确称取植物材料(果肉或者去叶脉的叶片)0.4g，剪碎，置于4℃预冷的研钵或匀浆器中，加入预冷提取液1ml，低温研磨至匀浆后转移至离心管，用3ml提取液冲洗研钵或匀浆器并转入离心管，加提取液至总体积为4ml，4℃ 10000r/min离心20min，上清液为酶提取液，上清液可用于SOD的检测。注意：如果SOD酶活性较低，应相应减少提取液的总体积，以便提高SOD酶的浓度。

⑤上述样品准备完毕后可以BCA蛋白定量检测试剂盒测定蛋白浓度，通常10-20μg蛋白的细胞或组织匀浆液样品其中的SOD平均活力约1个活力单位左右(不同细胞和组织的差异会比较大，该活力范围仅作为初步的参考)；每种样品准备20～100μg蛋白量通常已经足够用于后续检测，根据蛋白浓度和预计的蛋白使用量，用该试剂盒提供的SOD提取液适当稀释样品，例如小鼠肝脏组织10%匀浆液(组织和匀浆液的重量比为10%)上清，通常需要稀释10～100倍，准备好的样品如果当天测定，可以冰浴保存；如果当天不能完成测定，可以-20℃冻存，但建议尽量当天完成测定。

2、 配制NBT酶工作液：按照每个反应1.6ml的体积，均匀混合1ml SOD提取液、0.3ml NBT显色液、0.3ml酶溶液，即可配置成1.6ml NBT酶工作液，根据待检测样品(包括标准品)的数量，配置适量的NBT酶工作液。具体配置方法可以参考下表，配制好的NBT酶工作液4℃或冰浴保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。注意：由于酶溶液的用量较少且易沉降，必须注意在使用前先轻轻离心一下，然后适当混匀后再使用。

3、 (选做)准备SOD标准品：需自备SOD标准品，用本试剂盒提供的SOD提取液将SOD标准品稀释至如下系列浓度：200、100、50、20、10、5、2U/ml，各取20μl参考样品进行检测。注意：为避免稀释后SOD酶活性的下降， SOD标准品宜现稀释现使用，该试剂盒对于SOD的检测并不需要SOD作为标准品，但可使用SOD标准品作为阳性对照或作为对SOD活性定量的参考。

4、 SOD加样：参考下表使用小离心管或试管设置空白对照管、光照对照管、测定管。并按下表依次加入待测样品和其它各种溶液，加入反应启动工作液后充分混匀。注意：加入反应启动工作液后反应即会开始，可以在低温操作或用排枪操作以减小各孔间因加入反应启动工作液的时间先后差异而导致的误差。

5、 SOD测定：混匀，取空白对照管置于暗处，其他各管置于4000Lx日光下反应20min，各管受光情况应一致，温度高时时间缩短，低时延长；反应结束后以不照光的空白对照管调零，用分光光度计或酶标仪测定560nm处吸光度，如果用分光光度计，比色杯光径1cm，加入的上清量因根据比色杯的最小量程而定。

五、计算结果：

SOD活力单位定义：以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位(U)。

液体中总SOD活力(U/ml)=(A_光照－A_测定)/(50%×A_光照×V_T)

组织、细胞匀浆液中总SOD活力(U/g)=(A_光照－A_测定)×V/(50%×A_光照×V_T×W)

血液中总SOD活力(U/gHb)=(A_光照－A_测定)×V×C/(50%×A_光照×V_T×Hb)

式中：A_光照=光照对照管的吸光度

         A_测定=测定管的吸光度

         V=样品液总体积(ml)

          V_T=测定时样品所用体积(ml)

          W=样品鲜质量(g)

          C=1ml/采血量(ml)

          Hb=血红蛋白含量(gHb/ml)

六、注意事项:

1、 上述低温试剂避免反复冻融，以免失效或效率下降。

2、 待测样品-70℃可保存1个月，需注意反复冻融会导致SOD部分失活。

3、 细胞或组织等样品制备时不能采用含有Triton X-100等去垢剂的溶液，否则会干扰本试剂盒的检测。

4、 抗氧化物会对本试剂盒的检测产生干扰，例如0.1mM ascorbic acid，5mM GSH都会使测定出来的吸光度显著升高。

5、 对于植物样品，研磨处理应迅速，以免SOD酶活下降，尽量处于冰浴状态处理。

6、 如果无4000Lx日光，可200W在10~12cm处垂直照射20min；在超净工作台5cm垂直照射30min左右；在强太阳光下垂直照射30min左右。

7、 一般要求各管受光情况一致，所有反应管应排列在与日光灯管平行的直线上。

8、 反应温度控制在25℃，视酶活性高低适当调整反应时间；温度较高时，光照时间应缩短；温度较低时，光照时间相应延长。

9、 所用离心管或试管应洁净透明，透光性好。

10、 如果配制的NBT酶工作液出现淡黄色沉淀或絮状物应弃用，否则效果不佳。

11、 如果用酶标仪，96孔板每孔应加20μl上清液，相应检测的次数大大增加。

12、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。