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甲醛脱氢酶(FDH)测试盒

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    意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

甲醛是一种能与蛋白质、核酸和脂类产生非特异性反应的活泼化合物,对所有生物都具有很高毒性。甲醛脱氢酶作为含锌中等链醇脱氢酶(ADH)的家庭成员之一,广泛存在于原核和真核生物中,该酶能利用NAD+作为辅酶,将有毒的甲醛氧化,是甲醛氧化途径中的关键酶。

 

测定原理:

甲醛脱氢酶催化甲醛和NAD+产生NADH,在340nm处的吸光值会增加,测定340nm处的吸光值变化,可计算得到甲醛脱氢酶的活性。


自备实验用品及仪器:

天平、离心机、分光光度计1mL玻璃比色皿、蒸馏水。


试剂组成和配制:

提取液:液体60mL×1瓶,4℃保存。

试剂一:液体30mL×1瓶,4℃保存。

试剂二:粉剂×1瓶,-20保存;临用前加入15mL水溶解待用,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂三:粉剂×14℃保存;临用前加入3mL水溶解待用。

试剂四:液体3mL×14℃避光保存。


FDH提取:

1. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液)进行冰浴匀浆,然后10000g4℃,离心20min

2. 细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~10001的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后10000g4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。

3. 液体:直接检测。

 

测定操作表:

1、 分光光度计预热30min,调节波长至340nm,蒸馏水调零

2、 操作表

比色皿中加入如下试剂

 

测定管

样本(µL

100

试剂一(µL

550

试剂二(µL

250

试剂三(µL

50

试剂四(µL

50

混匀,于340nm下测定初始吸光值A15min后的吸光值A2△A=A2-A1

若样本数量较多,可将试剂按比例配成工作液使用。

 

FDH酶活计算:

1)按蛋白浓度计算

酶活定义:每毫克蛋白每分钟催化还原1nmol NAD+的酶量为1个酶活单位。

2)按样本质量计算

酶活定义:每克样品每分钟催化还原1nmol NAD+的酶量为1个酶活单位。

3)按照细胞数量计算

酶活定义:每104个细胞每分钟催化还原1nmol NAD+的酶量为1个酶活单位。

4)按液体体积计算

酶活定义:每mL样本每分钟催化还原1nmol NAD+的酶量为1个酶活单位。

NADH微摩尔消光系数,6.22×10-3 L/µmol/cmd比色皿光径,1cmV反总:反应体系总体积,1mLV样:反应体系中样本体积,0.1mLV样总:加入提取液体积,1mLT,反应时间,5minCpr:样本蛋白浓度,mg/mLW:样本质量,g

 

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