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NAD激酶(NADK)试剂盒

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     意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

NADKEC 2.7.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中是目前所发现的生物体内惟一能够催化NAD+磷酸化生成NADP+的酶,可催化NAD(H)ATP或无机多聚磷酸[poly(P)]作为磷酰基供体进行磷酸化反应,生成NADP(H)。因此,NAD激酶在合成NADP(H)以及调节NAD(H)NADP(H)的平衡上具有重要作用。

 

测定原理:

NADK催化NAD+磷酸化,生成NADP+NADP+可被6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原为NADPH340 nm下测定NADPH增加速率。可反映出NADK活性的大小。

 

自备的仪器和用品:

可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿和蒸馏水。

 

试剂的组成和配制:

提取液:液体50 mL×1瓶,4保存

试剂一:液体25 mL×1瓶,4保存;

试剂二:液体50 mL×1瓶,4保存;

试剂三:粉剂×1-20 保存

试剂:粉剂×1-20保存;

 

样本测定的准备:

1、细菌、细胞或组织样品的制备:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~10001的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g:提取液体积(mL)15~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4离心10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤

1、分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2、将试剂一和试剂二37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴15min以上。

3、工作液的配制:在试剂三中加入12mL试剂一,充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

   工作液的配制:在试剂四中加入45mL试剂二,充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

4、加样表

试剂名称(μL)

测定孔

对照管

样本

100

100

工作液

400

 

试剂一

 

400

充分混匀,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴15min,立即煮沸

2min(盖紧,防止水分散失)冰浴冷却,10000g25℃离心10min,取上清

上清液

200

200

工作液

800

800

加完试剂混匀,室温静置15min340nm下测定吸光值,ΔA=A测定-A对照。

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