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多酚氧化酶(PPO)试剂盒

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     意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:                           

PPOEC1.10.3.1)主要存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是一种含铜的氧化酶,能使一元酚和二元酚氧化产生醌,从而引起褐化,与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。

 

测定原理:

PPO能够催化邻苯二酚产生醌,后者在525nm有特征光吸收。

 

自备的仪器和用品

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰蒸馏水

 

试剂组成和配制

提取液:液体60mL×1瓶,4保存;

试剂一:液体40mL×1瓶,4保存;

试剂二:液体10mL×1瓶,4保存;

 

粗酶液提取

1、细菌、细胞或组织样品的制备:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~10001的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4离心10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g:提取液体积(mL)15~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4离心10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)或果汁样本的处理:

按照血清(浆)或果汁体积(mL:提取液体积(mL)15~10的比例(建议0.1mL血清(浆)或果汁加入1mL提取液进行冰浴匀浆。8000g 4离心10min,取上清,置冰上待测。

 

测定步骤:

1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至525nm,蒸馏水调零。

2、 样本测定(在EP管中依次加入下列试剂)

试剂名称(μL

测定管

对照管

样本

180

 

煮沸的样本

 

180

试剂一

720

720

试剂二

180

 

蒸馏水

 

180

37(哺乳动物)25(其它物种)中准确水浴10min后,95水浴5min

充分混匀,10000g25℃离心10min,取上清,525nm处检测测定管和对照管吸光度。ΔA=A测定管-A对照管。

注意:煮沸样本的操作:取300μL离心上清于EP管中,进行5min 95水浴处理;每个测定管需要设一个对照管,可以在不同对照管中加入不同样品的粗酶液,然后集中进行5min 95水浴处理。

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