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脲酶(Urease)测定试剂盒

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     意: 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

UE能够水解尿素,产生氨和碳酸。UE活性与有机物质含量、全氮和速效含量呈正相关,反应了氮素状况。

 

测定原理:

利用靛酚蓝比色法测定脲酶水解尿素产生的NH3-N

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1ml比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

 

试剂的组成和配制:

提取液液体50mL×1瓶,4℃保存;

试剂:粉剂×1瓶,临用前加入5mL蒸馏水,充分溶解待用,4℃保存;用不完的试剂4保存;

试剂:液体12mL×1瓶,4℃保存;

试剂A液:液体×14保存;试剂B液:液体×1瓶,4℃保存;临用前将A液倒入B液中混合,待用;用不完的试剂4保存一周;

试剂:液体5mL×1瓶,4℃保存;

 

样本的前处理 

1、细菌、细胞或组织样品的制备:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~10001的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4离心10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g:提取液体积(mL)15~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4离心10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)样品:直接检测。

 

测定步骤:

1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至578nm,蒸馏水调零。

2酶促反应

试剂名称

测定管

对照管

样本μL

20

20

试剂μL

90

 

蒸馏水(μL

 

90

试剂μL

190

190

混匀,放入37水浴1h后,10000g 25离心10min,取上清液。

 

2、将上清液稀释10倍(取0.1mL上清液,加入0.9mL蒸馏水)。

3、测氨量(在1ml比色皿中加入下列试剂)

 

测定管

对照管

稀释后的上清液(μL

400

400

试剂μL

75

75

试剂μL

75

75

充分混匀,室温放置20min

蒸馏水(μL

450

450

混匀,于578nm,蒸馏水调零,读吸光值A计算ΔA=A测定管-A对照管每个测定管设一个对照管。

 

UE活力计算:

标准条件下测定的回归方程为y = 0.0915x +0.0373x为标准品浓度(μg/mL),y吸光值A

1、血清(浆)UE活力的计算:

单位的定义:每mL血清(浆)每分钟产生1μg NH3-N定义为一个酶活力单位。

UE活力(μg/min/mL(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V反总÷V÷T=27.32×(ΔA -0.0373)

单位的定义:每天g土样中产生1μg NH3-N定义为一个酶活力单位。

2、组织、细菌或细胞1μg NH3-N活力的计算:

1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1μg NH3-N定义为一个酶活力单位。

UE活力(μg/min/mg prot)=(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V反总÷(V×Cpr)÷T =27.32×(ΔA -0.0373) ÷Cpr

2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟产生1μg NH3-N定义为一个酶活力单位。

UE活力(μg/min/ g 鲜重)=(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V反总÷(W× V÷V样总)÷T =27.32×(ΔA -0.0373) ÷W

3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1μg NH3-N定义为一个酶活力单位。

UE活力(μg/min/104 cell)=(ΔA-0.0373) ÷0.0915×10×V反总÷(500×V÷V样总) ÷T=0.0546×ΔA

10:稀释倍数;T:反应时间,60min V反总:反应体系总体积0.3mLV样:加入反应体系中样本体积0.02mLV样总:提取液体积,1mLCpr样本蛋白质浓度,mg/mL W:样质量, g500细菌或细胞总数,500万。

 

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