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半胱氨酸(Cys)含量试剂盒

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 测定意义:

蛋白质含有三种含硫氨基酸:甲硫氨酸胱氨酸Cys。其中,Cys是唯一一种含有巯基的含硫氨基酸,从甲硫氨酸转化而来,并且可与胱氨酸互相转化。Cys参与蛋白质二硫键的形成,经常是蛋白质活性中心的组成部分,还可以为其它生理生化反应提供巯基。此外,Cys大量积聚在皮肤和粘膜表面,在角蛋白生成中维持重要的琉基酶的活性,并且补充硫基,以维持皮肤的正常代谢,调节表皮最下层的色素细胞生成的底层黑色素。具有美白、解毒、改善炎症和过敏性皮肤等作用。


测定原理:

半胱氨酸与磷钨酸反应,可将磷钨酸还原成钨蓝,在600nm处有吸收峰,通过测定钨蓝的生成量,即可计算出半胱氨酸含量。


自备仪器和用品:

酶标仪、低温离心机、可调式移液枪、酶标板和蒸馏水。


试剂组成和配制:

试剂一:液体×1瓶,4保存。

试剂二:液体×1瓶,4保存。

试剂三:液体×1瓶,4保存。

标准品:液体×1支,1μmol/mL半胱氨酸标准液,4保存。


样品中半胱氨酸提取:

1. 液体样品:取50μL液体样品,加试剂一450μL,充分混匀,11000 rpm 4离心10min,取上清液,即待测液。

2. 组织样品:称取约50mg组织,加入500μL试剂一,冰上充分研磨,11000 rpm 4离心10 min,取上清液,即待测液。


测定:

1. 酶标仪预热30min以上,调节波长到600 nm,蒸馏水调零。

2. 空白孔:取酶标板,在空白孔中加入20μL蒸馏水,90 μL试剂二,90 μL试剂三,室温静置15min,于600 nm测定光吸收,记为A空白。

3. 标准孔:取酶标板,在空白孔中加入20μL标准品,90 μL试剂二,90 μL试剂三,室温静置15min,于600 nm测定光吸收,记为A标准。

4. 测定孔:取酶标板,在空白孔中加入20μL待测液,90 μL试剂二,90 μL试剂三,室温静置15min,于600 nm测定光吸收,记为A测定。


半胱氨酸含量计算:

1. 按液体样品的体积计算:

半胱氨酸含量(μ mol/mL)

=C标准×(A测定-A空白)÷(A标准-A空白)×(500μL÷20μL)×1mL÷50 μL

=500×(A测定-A空白)÷(A标准-A空白)

C标准:标准品浓度,1μmol/mLV标准:加入标准品体积(mL),20μL=0.02 mL

2. 按鲜重计算:

半胱氨酸含量(μ mol/g FW)

= C标准×(A测定-A空白)÷(A标准-A空白)×(500μL÷20μL)÷W

=25×(A测定-A空白)÷(A标准-A空白) ÷W

W:组织样品质量(g)。

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