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Bsu DNA聚合酶是具有链置换活性的DNA恒温扩增聚合酶,主要应用于RPA重组酶扩增。重组酶UvsX与引物结合形成的蛋白-DNA复合物,能在双链DNA中寻找同源序列;一旦引物定位了同源序列,就会发生链交换反应,Bsu DNA聚合酶启动DNA合成,对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合,防止进一步替换。 本Bsu DNA 聚合酶来源于 嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus subtilis),系将Bacillus subtilis DNA 聚合酶(Bsu) I 基因的前296个AA截去而得。该酶保留了Bsu I 的 5´-3´ 聚合酶活性,但是缺失了 5´-3´ 核酸外切酶结构域,该酶自身缺失 3´-5´ 核酸外切酶活性,可用于重组酶扩增。 | ||
应用 | ||
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活性定义 | ||
在37℃条件下,30min内参入10nmol酸性不容物定义为1个活性单位。 | ||
性能测试 | ||
按照如下体系配制反应: Plasmid DNA 100 ng 10×Bsu Reaction Buffer 5 μl Random9 (100μM) 2 μl dNTP mixture(10 mM) 2 μl Rnase free H2O upto 50 μl 混匀后95℃ 5min,然后冰上放置5min,分别加入不同剂量Bsu DNA聚合酶(泳道1-2:0, 泳道3-4:0.5 μl, 泳道5-6:1 μl,泳道7-8:2 μl,泳道9-10:4 μl,),分别在25℃和37℃孵育3h,电泳检测各组产物如下图 | ||
1X Bsu Reaction Buffer | ||
50 mM NaCl ,10 mM Tris-HCl (Ph7.5) , 10 mM MgCl2 , 1 mM DTT | ||
储存 | ||
-20℃可保存2年,避免反复冻融。 | ||
热失活 | ||
75°C,20min。 | ||
注意事项 | ||
1、由于缺乏3 ´-5 ´核酸外切酶活性,Bsu DNA 聚合酶不能切除 3´未配对的突出末端,因而不适用于生成平齐末端。 2、25℃ 时 Bsu DNA 聚合酶 保留 50% 的活性,是同温度下 Klenow 片段(3´-5´ exo-)的两倍。 |
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