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GV3101 农杆菌感受态细胞
GV3101 Chemically Competent Cell
保存条件： -80℃
产品规格:
| GV3101 | 10x100μl |
| pCAMBIA2301 (control vector) | 10ng/ul ；10ul |
| 基 因 型 |
C58 (rif R) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gentR/strepR) Nopaline
| 简 要 说 明 |
GV3101 菌株为 C58 型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因 rif，为了便于转化操作，此菌株携带一 无自身转运功能的胭脂碱型 Ti 质粒 pMP90 (pTiC58DT-DNA) ，此质粒含有 vir 基因(vir 基因是 T-DNA 插入植物基因 组必需的元件，pMP90 (pTiC58DT-DNA)质粒自身的 T-DNA 转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体 T-DNA 顺 利转移)。 pMP90 (pTiC58DT-DNA)型 Ti 质粒含有筛选标签：Strep 和gent ，赋予 GV3101 菌株链霉素和庆大霉素抗 性，适用于拟南芥、烟草、玉米、土豆等植物的转基因操作，GV3101 化转感受态经特殊工艺制作，经 pCAMBIA2301 质粒检测转化效率可达 104cfu/μg。
| 操 作 说 明 |
1. 取-80℃保存的农杆菌感受态于冰上待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。
2. 每 100μl 感受态加 1ug (体积不大于 10ul) 质粒 DNA，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置 5 分钟、液氮 5 分钟、 28℃水浴 5 分钟、 冰浴 5 分钟。
3. 加入 700μl 无抗生素的 LB 或 YEB 液体培养基， 于 28℃振荡培养 2~3 小时。
4. 6000rpm 离心一分钟收菌，留取 100μl 左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的 LB 或 YEB 平板上，倒 置放于 28℃培养箱培养 2-3 天(当平板只含有 50ug/ml kan 时，28℃培养 48h 即可；平板中同时加入 50ug/ml kan ，20ug/ml rif 时， 需 28℃培养 60h ；如果使用的平板含有 50ug/ml rif 则需要 28℃培养 72-90h)。
| 注 意 事 项 |
1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的 1/10 ；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大
一倍，转化效率下降一个数量级。
2. 混入质粒时应轻柔操作。
3. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
4. 利福平浓度不应高于 25ug/ul ，过高的利福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。本公司感受 态计算转化效率时所用平板只含有 50ug/ml kan ，若所用平板含有 20ug/ml rif 则转化效率降低到 1/2。
5. 培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、 筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止 Ti 质 粒丢失，但链霉素不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素，Ti 质粒丢失的 概率极低(可以忽略)。
备注：
1. 农杆菌相关抗生素配方：
| 抗生素 | 配方 | 原液 | 工作液 |
| 羧苄青霉素(carb) | 双蒸水溶解， 0.22um 滤膜过滤除菌 | 50mg/ml | 50ug/ml |
| 硫酸卡那霉素(kan) | 双蒸水溶解， 0.22um 滤膜过滤除菌 | 50mg/ml | 50ug/ml |
| 链霉素(strep) | 双蒸水溶解， 0.22um 滤膜过滤除菌 | 10mg/ml | 50ug/ml |
| 利福平(rif) | DMSO 溶解， 0.22um 滤膜过滤除菌 | 10mg/ml | 20ug/ml |
| 庆大霉素(gent) | 双蒸水溶解， 0.22um 滤膜过滤除菌 | 20mg/ml | 40ug/ml |
2. 常用农杆菌抗性： (R：抗；S：敏感。)
| 农杆菌菌株 | 羧苄青霉素(carb) | 链霉素(strep) | 利福平(rif) | 庆大霉素(gent) | 硫酸卡那霉素(kan) |
| AGL- 1 | R | R | R | S | S |
| EHA105 | S | R | R | S | S |
| LBA4404 | S | R | R | S | S |
| GV3101 | S | R | R | R | S |
3. LB 及 YEB 配方：
| component | LB(液体)/L | LB(固体)/L | component | YEB(液体)/L | YEB(固体)/L |
| Tryptone | 10g | 10g | Tryptone | 5g | 5g |
| Yeast extract | 5g | 5g | Yeast extract | 1g | 1g |
| NaCl | 10g | 10g | 牛肉浸膏 | 5g | 5g |
| NaOH | 调 PH 到 7.0 | 调 PH 到 7.0 | 蔗糖 | 5g | 5g |
| Agar | － | 15g | MgSO4 *7H2O | 0.49g | 0.49g |
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| NaOH | 调 PH 到 7.0 | 调 PH 到 7.0 |
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| Agar | － | 15g |
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