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猴D型逆转录病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒

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猴 D 型逆转录病毒(Simian Type D Retrovirus, SRV)会引起猴获得性免疫缺陷综合征,也就是猴艾滋病,该病在非洲的爆发导致了黑猩猩种群数量的下降,患病的黑猩猩有类似晚期人艾滋病患者的器官及组织损坏的症状,受感染的黑猩猩有比未被感染的高 10 至 16 倍的死亡风险,被感染的雌性的生育力下降,还可能将病毒传给它们的幼儿,这些幼儿死亡率也比未受感染的雌性幼儿更高,该病毒对人类研究艾滋病毒具有重要意义。
本产品就是以探针法荧光定量RT-PCR 技术为基础开发的专门检测猴 D 型逆转录病毒型的试剂盒,
它具有下列特点:
1. 即开即用,用户只需要提供样品 RNA 模板。
2. 引物和探针经过优化,分析灵敏性高。
3. 提供阳性对照,便于区分假阴性样品。
4. 特异性高,引物是根据猴 D 型逆转录病毒高度保守区设计,不会跟其他病毒的 RNA 发生交叉反应。
5. 既可用于定性检测,又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为 5个数量级。
6. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 RT-PCR 反应。
7. 本产品只能用于科研
一、稀释标准曲线样品(以 10E1-10E6 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能染样品或本试剂盒的其他成分。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管,分别为 6,5,4,3,2,1。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 RT-PCR 专用模板稀释液,最好用带芯枪头,下同。
3. 在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头,在 4 号管中加入 5 μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E4 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 RNA 的制备
7. 如果有 N 个样品,最好设置 N+2 个提取,多出的是 PC(样品制备阳性对照)和 NC(样品制备阴性对照)。可以取阳性对照的 1000 倍稀释液 10μL 再加上一定量的水,使总体积与待提取样品的规定体积一致,以此作为 PC。另外用水作为 NC。
8. 用自选方法纯化样品的 RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的柱式病毒 RNAout 或免提取核酸释放剂。
三、Probe qRT-PCR 反应(20μL 体系,在样品制备室进行)
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复,则标记 N+9 个 RT-PCR 管,其中 N+2个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 RT-PCR 阴性对照(用水做模板),
6 个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做 1 次重复,则标记 N+4 个RT-PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 RT-PCR阴性对照(用水做模板),1 个用于 RT-PCR 阳性对照(用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板)。 
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