[产品使用方法]
1.人间充质干细胞完全培养基准备
将间充质干细胞无血清生长添加剂(MSCGs)在2-8*C过夜融化，按1:20比例加入基础
培养基中，即成为间充质干细胞完全培养基。
温馨提示:间充质干细胞完全培养基2-8*C避光条件下，可保存30天。若小量多次
使用，建议您将间充质干细胞无血清生长添加剂(MSCGs)分装后，保存于-20°C冰箱,可
避免培养基不必要的浪费。
2.人间充质干细胞复苏(以T-75瓶为例)
①从冰箱中取出完全培养基，在生物安全柜或超净台中吸取适量(如T-75瓶: 10-
15mL)完全培养基沿_上表面加入间充质干细胞培养瓶中,切勿冲到细胞培养瓶底面，即:
细胞生长面。然后慢慢将细胞培养瓶平放，在37°C. 恒温CO2培养箱中放查5- 10分钟后
使用。
温馨提示:请严格按照此步骤操作，否则可能会出现细胞培养瓶中细胞生长空白区
域，即所谓的“生长空洞”。多数用户使用的不是专用的预包被细胞培养瓶，而是普通的
细胞培养瓶或培养皿，其表面环境并不利于无血清培养环境下的间充质干细胞贴壁。
37C放置5-10分钟，可让培养基中的促贴壁物质更好地与细胞培养瓶底部结合,使得间
充质干细胞的贴壁能力增强，降低“生长空洞”出现的概率。
②从液氮中取出冻存的间充质干细胞，迅速将冻存管放入37°C水浴中，快速融解。
温馨提示:尽可能避兔水没过管帽，以减少污染的风险;要快速完成细胞复苏过程
(尽量控制在1分钟内) ,融化过程时间过长，会造成复苏后细胞活性较差。
③用70%-75%酒精消毒冻存管外壁，在生物安全柜或超净台中打开冻存管，用吸管/
移液器将细胞冻存悬液缓慢移入装有5-10mL细胞完全培养基的15mL离心管中(在这一
过程请尽可能避免产生气泡)。
温馨提示:为了减少细胞损失，往细胞冻存管中加入1mL完全培养基,稍微吹打，用
吸管/移液器将这1mL的细胞悬液吸入离心管中，再用吸管/移液器将离心管中的细胞轻轻
吹打混匀。
④1200rpm离心5min，弃上清，加入2mL完全培养基重悬细胞，台盼蓝染色计数，
按密度2x 104ells/cm2将细胞接种至步骤①中孵育完的细胞培养瓶中，添加细胞时，将
细胞培养瓶竖立，细胞悬液直接加到底部，切忌冲到细胞培养瓶底面。
⑤轻轻摇晃细胞培养器皿，使细胞均匀分布，混匀后，置于37°C. 5%CO2、饱和湿
度的培养箱中静置培养。
⑥24h后，更换新鲜的完全培养基(温育至37°C) 。
3.人间充质干细胞传代(以T 75瓶为例)
①在显微镜下观察细胞，当细胞融合度达到80-90%， 即可传代。
温馨提示:细胞融合度请勿超过90%。很多传代后的细胞大比例死亡，是由于传代
前细胞生长过密(融合度过高)， 导致细胞消化异常(细胞整片或成片脱落)， 加之随后
的不当操作(如用移液器反复吹打成片细胞使其成为单个细胞)，此机械损失过程会严重
损害细胞膜，引发大比例的细胞死亡;间充质干细胞经冻存后再次使用时,尤为明显。
②预处理细胞培养瓶，处理方法同细胞复苏中的步骤①.
③在生物安全柜或超净台中，弃去细胞培养瓶中的培养液，加入5- 10mL PBS清洗细
胞后弃去，再加入2mL 0.05%胰酶EDTA消化细胞。
④在显微镜下观察到细胞变园时，立即加入5mL胰酶抑制剂终止消化。
⑤用移液器轻轻吹打瓶壁上还未完全脱离的细胞，并轻轻吹打混匀，使细胞完全分
散。
⑥将细胞悬液转移至15mL离心管中，1200rpm离心5min. 弃上清，加入2mL细胞
完全培养基重悬细胞，台盼蓝染色计数,按细胞密度2x 1o4ells/cm2,将细胞接种至细
胞传代②步骤中孵育完的细胞培养瓶中，添加细胞时，将细胞培养瓶竖立，细胞悬液直接
加到底部，切忌冲到细胞培养瓶底面。
⑦轻轻摇晃细胞培养器皿，使细胞均匀分布，混匀后，置于37°C、 5%CO2. 饱和湿
度的培养箱中静置培养。
4、人间充质干细胞冻存
①用0.05%胰酶-EDTA消化待冻存的细胞，加入胰酶抑制剂终止消化并离心，重悬后进
行细胞计数。
②1200rpm离心5min,弃上清。
③根据细胞计数情况，缓慢加入适量冷的无血清东存液(无血清冻存液可即拿即用或置
于冰袋备用)，调整细胞密度在1×10?cells左右。
④轻轻地重县细胞，将重县均匀的细胞按等份加入到灭莹的冻存管中(需提前做好标
记)，旋紧冻存管盖。
⑤迅速将冻存管放入程序降温盒中，然后将冻存盒直接放入-80°C冰箱。
⑥过夜放置后，将细胞从-80°C冰箱转移至液氮罐中长期保存。
