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PKH67/PI双染细胞毒性检测试剂盒50T￥ 1500100 个
产品简介:
PKH67/PI双染细胞毒性检测试剂盒是利用细胞荧光染料PKH67和PI对细胞进行染色，利用PKH67标记靶细胞，PI标记死的靶细胞来区分不同的细胞，活的靶细胞成绿色，死的靶细胞成红色和绿色，从而检测细胞毒性作用。
根据不同的实验方案设计，可以用来检测化合物的细胞毒性作用。也可以用来检测杀伤性T细胞或NK细胞介导的细胞毒作用。
荧光染料PKH67是一种可对活细胞进行荧光标记的新型染料，可以标记活体细胞，通过与膜结构的脂质分子结合而标记细胞。对细胞毒性较小，荧光背景低，脂溶性高，能够轻易穿透细胞膜，有着强而稳定的绿色荧光。经PKH67标记的细胞可用于体外和体内增殖研究，且具有不会使邻近细胞染色的功能。
在细胞分裂增殖过程中，PKH67的荧光强度会随着细胞的分裂而逐级递减，标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半，根据这一特性，它可被用于检测细胞增殖，细胞周期的估算及细胞分裂等方面。PKH67标记细胞的荧光非常均一，并且分裂后的子代细胞的荧光分配也更均一。在细胞分裂增殖过程中，PKH67标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，荧光强度变为亲代细胞的一半，通过流式细胞仪根据荧光强度的不同，可检测出未分裂细胞，分裂一次（1/2的荧光强度），二次（1/4的荧光强度），三次（1/8的荧光强度），以及更多分裂次数的细胞。PKH67可检测分裂次数多达六次甚至更多。
除了用于细胞增殖检测，PKH67还可以用于细胞的体外盒体内示踪，标记后荧光在胞内表达稳定，阳性标记率达98%以上，标记细胞形态良好，能有效地观察细胞在体外的诱导分化情况；或将标记的细胞注入体内，可以有效的显示移植细胞在活体组织中的迁移及分化。
PKH67标记的细胞用于体内观察可以长达数周之久，它常被用来做活体细胞检测实验和用荧光电镜观察细胞长期活动的实验.PKH67毒性较小，不影响细胞的增殖能力。此方法操作简单，且不用放射性同位素，不存在安全隐患。可以更快速，更准确和更安全地得到想要的实验数据。
PKH67/PI标记细胞后通常用流式细胞仪进行细胞毒性检测。
PKH67标记细胞呈绿色荧光，荧光波长：λex=490 nm, λem=502 nm。流式检测时的激发波长可以选择488nm，此时的发射波长为502nm，使用流式细胞仪检测时可以采用FL1 detection channel。PI标记细胞呈红色荧光，流式检测时的激发波长可以选择488nm，此时的发射波长为647nm，使用流式细胞仪检测时可以采用FL2 detection channel。
PKH67标记的细胞除了流式细胞仪检测细胞毒性外，还可单染后用于细胞增殖检测，或者用荧光酶标板定量活细胞数目，或者用荧光显微镜进行均一染色的细胞示踪观察。
试剂盒组成：
| 产品编号 | 产品名称 | 500T | 1000T |
| 组份 A | PKH试剂 | 250μl | 500μl |
| 组份 B | PI染色液 | 1ml*5 | 1ml*10 |
| 说明书 | 1 | 1 | |
储存条件:
-20°C避光保存
【注】
l PKH67荧光探针在2-8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
l 开盖后组份按要求条件保存。
l 拆封后请尽快使用完！
有效期:一年
PKH67和PI荧光光谱
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检测方法:
l 流式细胞仪
l 激光共聚焦
l 荧光显微镜
适用样本:
l 动物细胞
试剂盒以外自备试剂和仪器:
仪器准备：
l 流式细胞仪/荧光显微镜/激光共聚焦
l CO2培养箱
l 离心机
l 移液器
l 冰箱
l 冰盒
试剂准备：
l 或者HBSS(Hank's Balanced Salt Solution: With: Calcium Magnesium Glucose:Without: Phenol Red。Components: CaCl2(anhydrous) 140mg/L(1.261mM)、MgCl2-6H2O 100mg/L(0.493mM)、MgSO4-7H2O 100mg/L(0.407mM)、KCI400mg/L (5.333mM)、KH2PO4: 60mg/L(0.441mM)、NaHCO3,350mg/L(4.167mM)、NaC1 1000mg/L(137.931mM)、Na2HPO4(anhydrous)48mg/L(0.338mM)、D-Glucose 1000mg/L(5.556mM)
l PBS 缓冲液(pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液(1X) )(phosphate buffer saline/Dulbecco's PBS:约含8mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、137mM NaC1和3mM KC1)
试剂准备：
l 离心管
l 吸头
l 96孔培养板
使用方法:
使用注意事项：
l 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
l 染色浓度根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异。
l 配制的 PKH67母液极易水解，建议分装保存，分装后用封口膜密封管口，再用锡箔纸包裹，最好和干燥剂一起用塑料袋密封，各-20℃冷冻保存。
l PKH67工作液应现配现用，不能提前配制，因为PKH67吸水会分解，影响染色效果。
l PKH67易被水解，在水溶液中会很快变质。母液请在使用过程中避免接触水。工作液在标记细胞的过程中和水接触是在许可的时间范围内的。
l PKH67溶解液在4℃,冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内,可以37℃水浴片刻至全部融解后使用。
l 不同的细胞种类标记后可以示踪的代次或时间差异较大，请根据实际情况或参考文献进行检测。
细胞毒性测定
细胞PKH67染色:
1、根据需要检测的细胞样品数,用HBSS将PKH67母液250-500倍稀释,配制成PKH67
染色工作液。不同的细胞需要根据预实验结果确定最佳染色浓度。如果荧光强度弱，可以适当提高PKH67的终浓度。如果背景太高，可以适当降低 PKH67的终浓度，请摸索条件找到最佳浓度。
【注】:
l 也可以用PBS等缓冲液或相应的无血清培养基稀释染料母液至所需浓度。
l 开始实验前，使用HBSS缓冲液或培养基稀释PKH67到需要的工作浓度。工作浓度为根据不同细胞的预实验结果确定的最佳工作浓度，一般染色终浓度400-1000倍稀释均可。
l 一般起始浓度按500 倍稀释即可。
l 为了降低过度加载染料导致的潜在背景和细胞毒性，在不影响实验结果的前提下应尽可能低浓度染色。
l 工作液现配现用。
2、将培养好的待测靶细胞消化后收集，用PBS洗涤2次。
【注】:
l 400g离心5分钟。
3、将待测细胞用染色工作液重悬，至细胞浓度大约10'/ml。
4、在37℃培养箱中避光孵育15-30 分钟。
5、加10倍体积的含血清培养基，400g离心5分钟。
6、离心后去上清，收集细胞，用HBSS或无血清培养基洗涤细胞1-2次，最后加入培
养基重悬细胞。
7、在37℃培养箱中孵育20-30分钟。
细胞模型制备:
1、收集待检测的靶细胞。
2、进行相应的毒性药物处理或者效应细胞处理。
【注】:
l 效应细胞和靶细胞比例根据需要自行设定。常见比例如6.25: 1: 12.5:1: 25:1等。
l 活的靶细胞成绿色:死的靶细胞成红色和绿色:死的效应细胞成红色，活的效应细胞成无色。
细胞毒性检测:
1、 收集制备好的毒性处理过的细胞模型。
2、 用500ul HBSS重悬细胞，加入10ul PI染色液，混匀。
3、 在2-8℃避光孵育5-15分钟。
4、 在 400g离心5分钟收集细胞。
5、 用500ul HBSS或 PBS重悬细胞。
6、 取50Oul细胞悬液，用流式细胞仪或荧光显微镜检测。
7、 根据流式结果计算死亡细胞百分率。被杀伤死亡的靶细胞被PI染上会出现在。PKH67+PI+区域，未杀伤的在 PKH67+PI-区域，得出被杀伤的靶细胞的比例。用这个比例再计算毒性。
细胞增殖测定
1、试剂配制:
从冰箱中取出 PKH67试剂，静置几分钟至室温，或者37℃水浴片刻后，离心盛放PKH67的管子，开盖前请务必离心几分钟让试剂充分落入管底后才能开盖。
2、根据需要检测的细胞样品数，用合适的溶液(如:无血清培养基，HBSS或PBS)
将PKH67母液250-500倍稀释，配制成染色工作液。
【注】
l 最佳的工作液浓度请根据不同细胞和自身的实验体系来调整。
l 一般细胞终浓度250倍稀释即可，有些细胞可能需要适当增加浓度。
3、将制备好的待测细胞用100ul染色工作液重悬，至细胞浓度大约10'/ml。
【注】
l 也可以进行原位染色，染色液足够覆盖细胞即可。
4、在2-8℃培养箱中孵育15-30分钟。
【注】
l 建议待标记细胞在染色工作液中于37℃孵育5min，再于4℃孵育15min。
l 低温孵育可降低细胞对染料的内吞作用，有助于染料对质膜的标记，并且降低染料定位细胞质囊泡的可能性。
5、离心后去上清，收集细胞，用PBS或无血清培养基洗涤细胞1-2次，最后加入PBS
或无血清培养基重悬细胞。
6、取500ul细胞悬液，用流式细胞仪检测。Ex/Em=490/502nm。
7、随后还可按照细胞的正常培养方法进行培养。
可以在荧光显微镜下直接观察标记效果，也可以在培养适当时间后再用流式细胞仪检测细胞增殖，或用于其他特定实验目的的细胞荧光示踪。
注意事项:
l 正式实验前请选取几个样本做预实验，以优化实验条件，取得最佳实验效果。
l 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失。
l 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。
l 样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。
l 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。
l 实验后完成后所有样品及接触过的器皿应按照规定程序处理。
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